结果展示
circMTO1吸附miR-9参与肝癌发展
1.样本来源
289例HCC和癌旁样本(7对样本用于芯片检测)
2.技术手段
circRNA芯片、circRIP(circRNA pull down)、FISH 、IHC、qPCR
为了进一步验证,研究者在261例HCC患者的样本中检测其表达量,发现circMTO1在87.4%(228例)的样本都是低表达的
收集116例HCC患者的生存期数据,通过在组织芯片上做原位杂交(ISH),发现circMTO1在这些样本中依然是显著下调,并且circMTO1的下调与HCC患者的不良预后显著相关
通过MiRanda 预测,有99个miRNA可能是circMTO1的靶标。利用RNA in vivo precipitation(RIP)检测到20个miRNA。其中miR-9与circMTO1共特异性富集。通过FISH发现circMTO1与miR-9共定位于胞浆中,以上的实验结果表明,circMTO1与miR-9在胞浆中结合。
细胞实验表明:HepG2和 SMMC-7721细胞中,沉默circMTO1表达会促进细胞的增殖及其迁移并抑制凋亡;QGY-7701和SK-Hep1 HCC细胞中过表达circMTO1则会促使细胞凋亡;沉默circMTO1或者过表达miR-9,都会使p21的mRNA和蛋白表达水平降低,而过表达circMTO1则会其相反的结果;抑制miR-9的表达可以明显减弱在circMTO1表达下调时介导的对p21蛋白及其mRNA水平的表达抑制效果。也可以阻断circMTO1沉默介导的细胞增殖和抑制凋亡的作用。
成瘤实验结果表明:皮下移植人类HCC组织构建HCC裸鼠移植瘤动物模型(SMMC-LTNM);circMTO1 沉默(siRNA)两周后,小鼠的肿瘤生长速度明显加快,血清AFP升高;体内敲低(knock down) circMTO1后,p21和下游的CDK2表达被抑制,细胞迁移和扩散的标记物MMP2和PCNA表达上调。
结果展示
1.主成分分析(PCA)
通过 PCA 分析,考察样品的分布情况,验证实验设计的合理性,生物学重复样品的均一性,用二维图展示。同组的样品在二维空间分布比较集中,说明这些基因选取具有代表性,生物学重复好。
2.差异 lncRNA 表达水平聚类分析
差异 lncRNA 表达水平聚类分析, 我们采用 log10(norm 值)进行lncRNA 表达量展示。同时也可以将差异lncRNA 的 norm 值通过Z 值方式进行展示。其中横坐标为样本,纵坐标为基因,不同的颜色表示不同的基因表达水平,颜色由蓝色至红色表示表达量从低到高。红色表示高表达基因,蓝色表示低表达基因。
3.互作网络分析
使用 Perl 或 Python 等脚本语言构建三种 RNA (mRNA-miRNA-ncRNA(lncRNA,circRNA))之间的关系。利用 Cytoscape软件,针对三种 RNA 之间的关系,构建出ceRNA network 网络关系图。