Nat Immunol | 复旦大学研究团队揭示BCKA作为信号代谢物被NOTCH2感知重塑肿瘤免疫微环境

为了研究BCAA代谢在肿瘤进展中的作用，建立了小鼠原发性肺肿瘤模型。敲除Bcat1或Bcat2会显著抑制小鼠肿瘤生长并延长生存期（图1a，b）。RNA-seq结果表明KPB1组差异基因主要富集在免疫相关通路中（图1c），而KPB2组在这些通路中表现出最小的富集（图1d）。这些结果表明：BCAT1可能在塑造TME中发挥免疫调节作用，这与BCAT2在维持癌细胞生存能力方面的内在代谢功能不同。

为探索BCAT1在肿瘤免疫中的潜在作用，对MC38 Bcat1 KO肿瘤组织进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。与对照组相比，Bcat1-KO的巨噬细胞比例明显降低，CD8 T细胞和NK细胞比例增加（图1e，f）。巨噬细胞的差异表达分析显示，Bcat1-KO中肿瘤抑制基因表达升高，antigen-presenting-related基因显著上调。 CD8T细胞的差异分析显示Bcat1-KO组表现出activation-associated基因富集。这些发现表明Bcat1-KO诱导了增强的抗肿瘤免疫反应。值得注意的是，KPB1肿瘤中T细胞（CD3）、B细胞（CD20）、树突状细胞（CD11c）、中性粒细胞（Ly6G）或NK细胞（NK1.1）的丰度没有显著差异；但KPB1肿瘤中TAM种群显著减少（图1g）。

图1 BCAT1调控肿瘤免疫微环境

BCAT1与CD68+CD206+巨噬细胞群体呈正相关（图2a、b）。BCAT1表达较高与预后较差相关（图2c）。Bcat1 KO显着降低了肿瘤生长，但这种作用在巨噬细胞耗尽后被消除（图2d）。这些结果表明BCAT1与BCAT2不同，通过影响巨噬细胞浸润来调节免疫TME。相关研究表明TME受到肿瘤来源代谢物的严重影响，促使作者进一步探究BCAT1是否通过代谢调节改变TME。为此对KPB1和KPB2小鼠的肿瘤间质液（TIF）进行代谢组分析（图2e）。Bcat1-KO组中BCKAs相关代谢物降低，但Bcat2-KO组保持不变（图2f、g）。BCKA补充挽救了在Bcat1-KO的肿瘤抑制作用（图2h）并恢复了巨噬细胞（图2i）。在临床样本中进行验证，发现BCKA与CD68+CD206+巨噬细胞比例正相关（图2j，k）。这些发现表明，BCAT1通过BCKA来塑造TAM以促进肿瘤进展。

图2 BCAT1通过BCKAs影响TAMs

为了进一步剖析BCKAs如何影响巨噬细胞功能，富集KPB1小鼠的巨噬细胞并进行RNA-seq（图3a）。结果表明，KPB1组的上调基因主要参与炎症和免疫反应（图3b）。此外，KPB1组中的促肿瘤标志物表达降低，而抗肿瘤标志物表达升高（图3c），表明BCAT1-BCKA驱动巨噬细胞走向免疫抑制或M2样状态。 为了进一步验证，BMDMs用条件培养基（CM）进行刺激，发现Bcat1-KO中BCKA水平显著降低（图3d，e）。由于免疫抑制巨噬细胞依赖于线粒体代谢和三羧酸循环，因此进行了能量代谢实验。发现Bcat1-KO CM降低了OCR，补充BCKA则恢复OCR(图3g)。在体内肿瘤模型中也观察到类似的结果：补充BCKA恢复了KPB1小鼠中F4/80 + CD206 +TAM的比例(图2i)，并增强了促肿瘤标志物的表达(图3h)。

为了评估TAM功能，使用GFP标记LLC细胞并分析其吞噬能力（图3i）。LLC细胞中的Bcat1-KO导致巨噬细胞具有明显的GFP信号，表明肿瘤细胞吞噬能力增强，而BCKA补充则逆转了这种作用（图3j）。TAM不仅通过损害吞噬功能来抑制抗肿瘤免疫，还有助于TME重塑和T细胞衰竭。免疫荧光显示，KPB1肿瘤中PD-1+CD8+T细胞较少，BCAT1-BCKAs在促进T细胞耗尽中的关键作用（图3l）。总的来说，BCKAs重编程巨噬细胞以促进T细胞衰竭，从而抑制抗肿瘤免疫。

图3 BCAT1-BCKA轴促进TAMs的免疫抑制表型

将BCKAs补充到培养基中会增加巨噬细胞BCKAs表达（图4a-b）。为了进一步探究巨噬细胞是否摄取肿瘤细胞分泌的BCKAs，用[13 C]亮氨酸标记肿瘤细胞培养基。在巨噬细胞中检测到[13 C]KIC，说明KIC的摄取来源于肿瘤细胞（图4c）。 总的来说，肿瘤细胞是TME中BCKAs的主要来源，通过BCAT1介导BCAA代谢产生。为了确定巨噬细胞中BCKA摄取的关键转运蛋白，使用sgRNA文库进行筛选，发现了Slc16a1（MCT1）（图4d-e）。进一步实验表明，Slc16a1敲除降低了BCKA表达（图4f），且显着降低了巨噬细胞摄取（图4g）。KPB1 TAM Slc16a1-KO小鼠表现出与KP TAM Slc16a1-KO相当的肿瘤体积（图4h），及相似的CD206+TAMs细胞群数量（图4i）。

图4 巨噬细胞通过SLC16A1摄取肿瘤细胞分泌的BCKAs

为了确定巨噬细胞中BCKAs的精确靶点，在BMDMs中进行了CRISPR筛选。筛选到了top 5候选基因，如Notch2（图5a，b）。Lyz2-Cre;Notch2flox/flox小鼠（敲除巨噬细胞中的Notch2）BMDMs对BCKA刺激没有反应（图5c，d）。将WT或Bcat1-KO LLC肿瘤细胞植入Lyz2-Cre;Notch2flox/flox小鼠体内，虽然Bcat1-KO减缓了Lyz2-Cre小鼠的肿瘤生长，但在Lyz2-Cre;Notch2flox/flox小鼠中被完全消除（图5f）。此外，在Lyz2-Cre;Notch2flox/flox小鼠中，CD206和CD301的表达水平不再受Bcat1-KO的影响（图5g）。KPB1 TAM-Notch2-KO小鼠表现出与KP Notch2-KO小鼠相似的肿瘤体积（图5h）和CD206+TAM细胞群（图5i）。这些结果表明Notch2是BCKAs诱导的巨噬细胞活化的关键调控因子。

图5 Notch2对BCKA诱导的巨噬细胞免疫抑制至关重要

BCKA可增加NICD2表达，而Notch2不受影响（图6a）。环己酰亚胺（CHX）追踪测定发现BCKAs显著增加了NICD2蛋白质稳定性（图6b）。泛素化测定证实BCKAs降低了NICD2泛素化（图6c）。鉴于之前的发现（BCKAs在TAMs中没有进一步分解代谢），因此假设BCKAs通过直接结合特定蛋白来调节NICD2泛素化。为了识别BCKA的潜在结合蛋白，使用质谱（MS）进行筛选（图6d）。令人惊讶的是，NOTCH2是BCKA组中丰富最高的蛋白质之一（图6e）。纯化NICD2蛋白并进行等温滴定量热法（ITC），证实了BCKAs和NICD2之间的直接结合（图6f）。此外， BCKAs显着损害了它们的结合（图6g）。为了探究PEST结构域在BCKA调控中的作用，构建了PEST结构域截断的NICD2突变体（NICD2ΔPEST），发现NICD2ΔPEST不再响应BCKAs（图6h）。

为了查明确切的BCKA结合位点，进行了PEST结构域的丙氨酸扫描诱变。TPSPESPD区域的突变（Thr2418，Ser2420，Pro2421，Glu2422，Ser2423，Pro2424）显着增加NICD2蛋白水平（图6i）。此外，确定了位于PEST域羧基末端区域的几个突变，这些突变在基础条件下不影响NICD2蛋白水平，但消除了NICD2对BCKAs的反应（图6i）。其中W2427A突变显示出最稳健效果，并进一步证实该突变显着消除了BCKA诱导的NICD2稳定（图6j）。ITC检测证实了BCKAs没有与NICD2 W2427A结合（图6k）。这些发现表明BCKAs直接与NICD2的PEST结构域结合，防止FBXW7介导的泛素化和降解，从而促进巨噬细胞活化。

图6 BCKA直接绑定到NICD2以减弱与Fbxw7的交互

为了确认BCKAs是否靶向Notch2，构建了Notch2 W2427A突变小鼠模型。KPB1 TAM-Notch2 W2427A小鼠表现出与KP TAM-Notch2 W2427A小鼠相当的肿瘤体积（图7a）和CD206+TAMs细胞数（图7b）。为了评估不同肿瘤类型中这种突变的影响，将LLC、MC38和B16细胞植入Lyz2-Cre；Notch2 W2427A小鼠。值得注意的是，Bcat1 KO不再影响这些小鼠的肿瘤生长（图7d）。这些结果表明Notch2是BCKA诱导的巨噬细胞激活的关键调控因子（图7e）。

图7 Notch2 BCKA结合突变体中止BCKA诱导的TAM激活