长期以来，乳酸（L-Lactate）一直被生物医学界视为无氧糖酵解的“代谢废物”。然而，近年来的研究彻底颠覆了这一认知：乳酸不仅是重要的能量“燃料”，能在细胞间和器官间传递（乳酸穿梭），还作为信号分子参与肿瘤微环境调节、免疫反应及神经元活动等多种生理病理过程。
乳酸监测对于理解复杂的病理生理机制至关重要，传统的测量手段（如HPLC、酶促电极），受限于空间分辨率、侵入性或采样时效，无法在单细胞分辨率下提供非侵入性的实时证据。为此，科学家们开发了一系列基因编码荧光探针，可以在活细胞甚至活体组织中实时、定量、高空间分辨率地观察乳酸动态，实时捕捉乳酸在细胞内外穿梭的瞬间。
目前主流的乳酸探针主要基于蛋白质工程策略，将乳酸的浓度变化转化为可见的光信号。
基于 E. coli 的转录因子 LIdR 开发，LIdR能特异性地结合 L-乳酸并发生构象改变，研究人员将其作为乳酸识别元件，并置于一对荧光共振能量转移（FRET）对（mTFP和Venus）之间。当乳酸结合LIdR时，会导致蛋白质构象发生改变，进而改变两个荧光蛋白之间的距离或方向，引起FRET效率下降（mTFP/Venus荧光比例变化）。Laconic 可检测范围横跨四个数量级（1 μM 至 10 mM），且不受哺乳动物细胞质中生理浓度的葡萄糖、丙酮酸、乙酸、β-羟基丁酸、谷氨酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、苹果酸或草酰乙酸的影响。该探针在星形胶质细胞、HEK细胞及T98G细胞（人脑胶质瘤细胞）中表达后，可动态监测单细胞内的乳酸水平。
Laconic成功定义了“瓦博格指数”（Warburg Index），即基础乳酸产生率与叠氮化钠诱导的乳酸积累率之比。实验数据显示，T98G胶质瘤细胞的指数为 4.1±0.5，而正常星形胶质细胞仅为 0.07±0.007，在单细胞水平上区分了胶质瘤细胞与正常星形胶质细胞的代谢差异。
研究者将循环排列荧光蛋白（cpGFP或cpmApple）插入乳酸结合蛋白（TTHA0766或LIdR）的特定位点。乳酸的结合直接影响荧光蛋白发色团周围的微环境变化，从而引发荧光强度的剧烈增强（直接响应）。
eLACCO系列基于周质结合蛋白（PBP）开发，PBP源自嗜热菌的TTHA0766，此类蛋白在分泌途径（ER/Golgi）的氧化环境中具有天然稳定性，使其成为细胞外监测的首选。
eLACCO2.1作为第二代绿色荧光细胞外L-乳酸探针是在第一代胞外探针 eLACCO1.1 基础上，通过定向进化和结构优化产生的“加强版”。eLACCO2.1具有优异的膜定位能力、稳定的荧光响应及更快的动力学：其通过HA引导序列+NGR GPI锚定实现高效膜定位，荧光响应值 ΔF/F 达到 14（10mM乳酸下），是 eLACCO1.1 的 3.5倍。此外，eLACCO2.1通过定向进化后在乳酸结合态下的分子亮度显著增强，响应速度更快，可检测脑切片及活体小鼠胞外L-乳酸动态。
图3 eLACCO2.1原理图及在急性脑切片中的验证
R-eLACCO2.1是基于cpmApple开发的红色细胞外L-乳酸探针，其开发过程始于将eLACCO1中的cpGFP替换为cpmApple，构建出R-eLACCO0.1，随后经定向进化优化，大幅提升了ΔF/F，并筛选特定的 N 端前导序列（Igκ）和 C 端锚定结构（COBRA），进行膜定位优化，最终得到R-eLACCO2.1，其在体内对胞外乳酸浓度升高的敏感性优于此前绿色荧光探针。R-eLACCO2.1 作为最新的红色荧光胞外乳酸探针不仅具备更深的组织穿透力，还实现了与绿色钙探针（GCaMP）的“光谱正交”，实现同步监测同一视野下神经元活动与胞外乳酸波动的因果关系。
R-iLACCO1利用cpmApple作为报告基团，基于LIdR设计，LIdR不依赖Ca2+，且能在Ca2+浓度较低的细胞质基质中发挥功能。作为首个高性能红色胞内探针，R-iLACCO1不仅降低了组织背景自发荧光，且其ΔF/F高达20，远超以往所有胞内探针，解决了复杂组织深层成像的穿透力瓶颈，能够捕捉到活体小鼠大脑中微弱的代谢波动。
为了适应不同细胞的基础乳酸水平，研究者开发了不同亲和力变体探针：R-iLACCO1（高亲和力，Kd为680 μM）、R-iLACCO1.1（中亲和力，Kd为3.0mM）和R-iLACCO1.2（低亲和力，Kd为4.0mM）。
R-iLACCO1（细胞质）和eLACCO2.1（细胞外）具有良好的光谱正交性，可以在同一细胞中实现“红绿双色”共表达，这种策略允许同步观察细胞内外乳酸浓度梯度，在实时监测乳酸跨膜转运效率方面的具有卓越能力，为解析代谢异质性提供了前所未有的工具包。
从Laconic的比率型开创，到eLACCO1.1的胞外探索，再到eLACCO2系列与R-iLACCO1的高性能探针在活体成像和深层组织监测中的广泛应用，乳酸探针技术已正式进入“单细胞动态感知时代”。乳酸探针的不断迭代，极大地丰富了我们的代谢监测工具箱，它不仅重塑了我们对基础能量穿梭的理解，更为癌症及神经退行性疾病的单细胞精准诊疗铺平了道路。
参考文献：
1.San Martín A, et al. PLoS ONE (2013).
2.Nasu Y, et al. Nature Communications (2021).
3.Nasu Y, et al. Nature Communications (2023).
4.Kamijo Y, et al. Nature Communications (2025).
