随着测序技术尤其是高通量测序技术的迅速发展，人们对基因组变异/基因表达差异与表型之间关系的认识越来越深刻。然而传统的Bulk RNA测序手段是针对细胞集合进行测序，而单个细胞特异性的信息往往被掩盖，导致错失很多重要信息。
10X Genomics平台首先利用微流控技术分选单个细胞，然后将带有barcode和引物的凝胶珠以及单个细胞包裹在油滴中；在油滴中凝胶珠溶解释放反转录oligo，细胞裂解释放mRNA，通过SMART法获得用于测序的带barcode的cDNA；液体油层破坏后，cDNA进行后续文库构建，使用Illumina测序平台检测，即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据，10min内自动完成多至80,000个细胞的捕获，细胞捕获率最高65%。可实现大量大细胞的快速高效标记、测序和分析，获得单细胞水平的基因表达谱和差异情况，并通过对复杂细胞群体进行深入细致分析，绘制大规模单细胞表达图谱。
样本类型
超高的细胞通量，利用10X Genomics平台实现真正的单细胞测序。
细胞捕获效率高，可实现大量大细胞的快速高效标记、测序和分析。
项目周期短，技术应用范围广。
技术路线
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组织裂解
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单细胞悬液
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细胞质检
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单细胞标记
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文库构建
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上机测序
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数据分析
分析内容
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1. 测序数据质控和定量 |
测序序列统计与质控 |
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数据定量 |
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多样本数据合并和定量均一化 |
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最终鉴定细胞表达量矩阵 |
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2.细胞亚群分类 |
细胞过滤 |
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单细胞亚群分类 |
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3.Marker基因分析 |
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4.差异基因富集分析 |
差异基因GO富集性分析 |
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差异基因KEGG富集性分析 |
样本类型
细胞悬液，组织等
代表性文章
Zheng H , Pomyen Y , Hernandez M O , et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2018.
Park J , Shrestha R , Qiu C , et al. Single-cell transcriptomics of the mouse kidney reveals potential cellular targets of kidney disease[J]. Science, 2018:eaar2131.
案例展示
Hepatology：单细胞分析显示肝癌干细胞的异质性
论文标题：Single-cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma
刊登日期：2018年7月
发表杂志：Hepatology
影响因子：14.079
研究机构：美国国家卫生研究院国家癌症研究所、曼谷朱拉蓬研究所、弗雷德里克国家癌症研究实验室
样本类型：肝癌细胞系（HuH1和HuH7) ，手术切除肿瘤样本P1
技术手段：单细胞测序（10X Chromium、SMART-seq）、流式分选
研究背景:
肝细胞癌（HCC，hepatocellular carcinoma）的肿瘤内分子异质性部分归因于肝癌干细胞（CSC，hepatic cancer stem cells）的存在。 由各种细胞表面标志物定义的不同CSC群体可能包含不同的致癌驱动因素，这在定义靶向疗法时构成了挑战。 研究人员在单细胞水平（10X Chromium、SMART-seq）上整合转录组学和功能分析用以评估CSC的异质性程度。结果表明，CSC在单细胞水平上的表型、功能和转录均存在异质性性，不同的CSC亚群具有不同的分子特征。而且有趣的是，不同CSC亚群内的不同基因与HCC预后相关，并且彼此相互独立，表明CSC异质性影响肿瘤内异质性和肿瘤进展。
文章结果:
大量数据表明CD13、CD24、CD44、CD90、CD133、EpCAM等表面标志物可以定义CSC，研究人员选择CD24、CD133、EpCAM分选HuH1和HuH7不同细胞亚群，用于研究CSC生物学和分子水平异质性。免疫荧光染色表明，在两种细胞培养形态下（单层培养、球体培养）,两个HCC细胞系均表现出明显的细胞异质性。
HuH1和HuH7细胞系（原始细胞数分别是1343、1134）正常培养和缺氧培养（促进细胞干性）2周后，研究人员依照三种表面标志物（CD24、CD133、EpCAM）分选细胞，HuH1和HuH7中标志物阳性的CSCs比例分别为15-20%、8-12%，而标志物阴性CSCs比例只有0-5%（下图A-B），培养后不同细胞亚群的自我更新能力差异很大（下图C-D）； 分选后的细胞经过1个月培养后，和未分的得细胞相比，CD133+、EpCAM+、CD24+、Triple+细胞能够扩大成为混合CSCs，而存活下的Triple-细胞能够扩大成混合CSCs，可能是由于部分细胞不是真正的标记阴性细胞，或者标记阴性细胞经历了转换变为标记阳性细胞（下图E）。
研究人员采用SMART-Seq方式分析HuH1和HuH7阳性标记细胞以及分选的P1（分选CD133+/CD24+/EpCAM+/CD45-细胞）细胞表达谱（单个细胞测序、10细胞混合测序、100细胞混合测序）信息，并与数据库中人胚胎干细胞（hESC）、鼠内皮细胞（mEC）和鼠造血干细胞（mHSC）表达谱数据做了比较，发现不同细胞类群具有不同的基因表达模式，且不同类型细胞中每个细胞的基因表达模式均存在差异，HuH7细胞间差异大于HuH1；当细胞混合（10细胞混合、100细胞混合）后这种差异程度明显降低（下图A）。而当单独聚类HuH7细胞时，发现不同标记细胞彼此可以区分（下图B）。以上数据均表明单细胞水平上转录组存在异质性。
研究人员比较了HuH7阳性标记细胞（Triple+）和阴性标记细胞（Triple-）基因表达差异，鉴定到的286个Triple+相关基因可以预测来自LCI队列的240例肿瘤样本、来自TCGA的250例肿瘤样本的整体生存率，但在非肿瘤样本中无意义。
不同标记CSC细胞群体基因表达比较分析，EpCAM+、CD133+、CD24+、Triple+特征基因基本不重合（下图A），IPA通路分析也表明不同细胞群体的通路也不重合（下图C-F），而且不同细胞群体特征基因可以用于生存期预测，且EpCAM+、CD133+比CD24+更有优势（下图B）。
为了整体了解细胞群体多样性，研究人员采用10X 单细胞测序方式，对3847个HuH1、HuH7、P1细胞进行了分析， HuH1可以分为2个亚群，HuH7分为4个细胞亚群，P1分为3个细胞亚群，细胞聚类结果与与SMART-seq结果类似（下图A）。CSC标志物，例如EpCAM、CD133 (PROM1)、CK-19 (KRT19) 和乙醛脱氢酶 (ALDH1A1) （下图B）以及HCC特异基因，AFP、MDK、GPC3、GOLM1、YY1AP1、PLK1, ECT2、NELFE（下图C）在不同细胞亚群中表达存在异质性。P1的3个细胞亚群中表达了山中因子 (KLF4、POU5F1、MYC)， 干细胞marker (NANOG)，白细胞marker(PTPRC), T细胞 markers (CD3E, CD8A) 和B细胞marker (CD79A) ，但其表达也存在异质性，其中第一个和第二个P1亚群为HCC浸润白细胞（分别表达T细胞marker和B细胞marker），第三个P1亚群主要为HCC细胞（下图D）。
参考文献
Hongping Zheng,et al. Single cell analysis reveals cancer stem cell heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Hepatology, 2018, doi：10.1002hep.29778
结果展示
1.单细胞亚群分类
针对PCA结果中选取前10个主成分，采用graph-based聚类方法对细胞进行分类。使用相同的数据进行t-SNE分析，然后将聚类结果在t-SNE映射中展示。
2.Marker基因分析
细胞群体Top10 Marker基因的小提琴图和表达映射图
3.差异基因KEGG富集性分析
Pathway通路图展示与说明：红色代表注释到某个ko节点且上调的显著差异表达转录本，蓝色代表注释到某个ko节点且下调的显著差异表达转录本，橘黄色代表注释到某个ko节点不仅有上调又有下调的显著差异表达转录本。方框内的4位数字表示各种酶的EC编号；空心圆圈表示小分子化合物；实心箭头表示生化反应的方向；虚线箭头连接其他的相关代谢途径。下图仅为报告中的展示图片
