最近科研界什么比较流行？
外泌体（Exosomes）是当之无愧的热点话题。不论在肿瘤领域、神经科学领域还是代谢领域，都有大量的外泌体相关文章发表，以探究外泌体的功能和机制。
要研究外泌体的功能，一般都会在细胞和动物水平分别进行验证，这个过程势必涉及到外泌体的示踪（标记），我们这次综合多篇文献，整理了外泌体示踪用到的方法。此外，有很多研究者对外泌体的动物注射用量也有较多疑问，这次一并整理给大家做参考。
外泌体示踪：
1. 亲脂性染料标记
目前已发表的外泌体文章中，外泌体大多使用亲脂性染料进行标记，体内和体外都有较多应用。亲脂性染料主要分为两大类，第一类是PKH67（绿色荧光）/PKH26（红色荧光），由于它们可以与外泌体的脂质双层膜稳定结合，所以染色效果较好，应用较广泛。
图1 PKH67标记的外泌体与神经元之间相互作用
Acta Neuropathol Commun. 2018 Feb 15;6(1):10.
图2 PKH26标记的外泌体与MDA‐MB‐231细胞共培养
Cancer Sci. 2019 Oct;110(10):3173-3182.
第二类是Di系列的亲脂性染料，包括DiI（橙色荧光）、DiO（绿色荧光）、DiD（红色荧光）、DiR（深红色荧光）。其中DiR的红外荧光可穿透细胞和组织，在活体成像中用来示踪。
图3 DiI标记的外泌体通过静脉注射观察在体内器官的分布情况
J Cereb Blood Flow Metab. 2018 May;38(5):767-779.
图4 DiO标记的外泌体与HCT116细胞共孵育
BMC Cancer. 2018 Jan 6;18(1):47.
图5 DiR标记的外泌体静脉注射小鼠结肠癌肿瘤模型
J Nanobiotechnology. 2020 Jan 9;18(1):10.
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2.慢病毒介导CD63-GFP表达
将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。
图6 用GFP标记的外泌体分别与SH-SY5Y、BV2和DRG细胞共培养
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
图7 注射有CD63-GFP的外泌体后观察第1天(D1)和第5天(D2)的荧光
Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2019 Dec;47(1):2918-2929.
3.用金纳米颗粒（Gold nanoparticles，GNPs）标记
将金纳米颗粒标记的外泌体通过鼻内给药不仅能进行无创跟踪，而且能促进外泌体在脑部的积累和延长在病变区域的存在时间，增强体内神经成像的效果。因此，这种外泌体标记技术可以作为多种脑疾病的强大诊断工具，并可能增强基于外泌体的神经恢复治疗。
图8 金纳米颗粒外泌体的制备及体内注射
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
图9 用金纳米颗粒和PKH26对外泌体进行双标记
ACS Nano. 2017 Nov 28;11(11):10883-10893.
4.用近红外（NIR）荧光探针进行标记
这是一种使用两亲性探针对NIR荧光标记的外泌体进行内源性检测的方法，无需对外泌体进行免疫标记或合成或色谱处理。由于NIR波长的荧光探针能穿透体内组织，从而提供了从细胞直接转换到体内使用的好处。
图10 未标记外泌体和NIR标记外泌体的原子力显微镜图片
Chem Commun (Camb). 2018 Jun 26;54(52):7219-7222.
5.用Gaussia luciferase（gluc）和截断的lactadherin标记
将gLuc-lactadherin构成融合表达的质粒，再将此质粒转染细胞，使细胞分泌的外泌体带有强的萤光素酶活性。将标记的外泌体进行静脉注射入小鼠体内，看外泌体在组织的分布情况。
图11 将表达了gluc-lactadherin的外泌体静脉注射入Balb/c小鼠
J Biotechnol. 2013 May 20;165(2):77-84.
小结1
外泌体标记对探究外泌体的功能是必不可少的一个步骤，首先需要观察到外泌体被受体细胞吸收或到达目的组织、器官，再检测受体细胞、组织或器官中相应指标的变化，看外泌体是否具有一定的功能。确定外泌体具有功能后，再通过高通量测序或基因芯片进行差异表达分子的挖掘，进一步深入研究机制。
外泌体的动物注射用量总结
案例1：
外泌体来源：间充质干细胞
标记方式：C5 Maleimide-Alexa 594
注射方式：脑室注射
注射用量：每只小鼠1.5mg/ml、20ul
观察部位：海马
炎症反应检测时间：4 days
文章来源：Mesenchymal stem cell-derived exosomes as a nanotherapeutic agent for amelioration of inflammation induced astrocyte alterations in mice
案例2：
外泌体来源：巨噬细胞
标记方式：PKH26
注射方式：静脉注射
注射用量：每只小鼠30ug，每7days注射一次
观察部位：肝脏、脂肪组织、肌肉
葡萄糖、胰岛素检测时间：12 days
文章来源：Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity
案例3：
外泌体来源：血清
标记方式：PKH67
注射方式：静脉注射
注射用量：每只小鼠约3-5*10的10次方particles/ml，200ul
观察部位：肺部
肺部炎症反应检测时间：24 h
文章来源：Peripheral Circulating Exosome-Mediated Delivery of miR-155 as a Novel Mechanismfor Acute Lung Inflammation
案例4：
外泌体来源：CAR-T细胞
标记方式：NHS-Rhodamine (Rho)
注射方式：静脉注射
注射用量：每只小鼠100-150ug，每周注射一次
观察部位：肿瘤组织
抗肿瘤活性检测时间：5-40 days
文章来源：CAR exosomes derived from effector CAR-T cells have potent antitumour effects and low toxicity
小结2：
动物的外泌体注射可以采用定位注射和静脉注射等，不同注射方法外泌体的用量不同，此外，不同的外泌体来源用到的外泌体量也不同，建议在做动物注射正式实验之前，可以先做个预实验，摸索合适的外泌体用量，一方面既可以展现外泌体的功能，另一方面也可以确保动物的存活率。
