基因与细胞治疗中质粒的大规模纯化生产工艺剖析

收集菌体有两种方式：1）离心；2）中空纤维切向流过滤。离心操作在工业生产过程中难以放大；而中空纤维有开放式的通道，能够处理高固含量（大肠杆菌发酵液）、高粘度（菌体裂解液）和剪切力敏感型样品（质粒），并且具有良好的线性放大能力。在这一步推荐使用750kD或0.1-0.2um的1 mm内径的中空纤维进行菌体的收集和清洗。

菌体裂解方法有很多，常用的是碱裂解，由Birnboim和Doly最早提出（Birnboim HC, Doly J. Nucleic Acids Res 1979;7(6):1513–23.）。在碱性条件下，大肠杆菌的蛋白质、RNA、宿主DNA和质粒释放至溶液中并变性。加入中和液后，大量变性的蛋白质和宿主DNA被沉淀，而质粒由于分子量较小，很容易复性并保留在溶液中。

当溶液I、II和III相继加完后，裂解液体积会变得非常大，在层析纯化前进行浓缩和洗滤，不仅可以大大减小样品体积，还可以有效去除RNA、色素和部分宿主蛋白、宿主DNA等杂质，减少层析阶段的负荷。对于质粒的超滤浓缩，一般按照如下表格标准进行NWMC的选择，中空纤维的低剪切力特点可以有效保护质粒的超螺旋构象。此外，平板膜包也可以用于本步超滤浓缩，但是根据不同质粒的大小，MWCO的选择可能与中空纤维的略有差异。

经过超滤浓缩后，样品中主要杂质有RNA残留、开环DNA和内毒素。针对这三种杂质，通过以下三步层析一一去除。

凝胶过滤层析的目的是去除大量RNA残留。高浓度硫酸铵（≥1.5 M硫酸铵）的平衡液使RNA和质粒的空间大小的差异性达到了最大，质粒通过层析柱的外水体积首先流出。组群分离（Group separation）模式使其上样体积达到了0.3CV。本步层析以后，质粒已经达到了很高的纯度，琼脂糖凝胶电泳几乎看不到RNA杂带，见如下电泳图所示。

亲和层析的主要目的是去除开环质粒。凝胶过滤得到的质粒被置换到高浓度硫酸铵的缓冲液，可以直接上样至亲和层析柱，在此条件下，开环和超螺旋质粒均与填料结合；上样结束后，首先用2.0 M硫酸铵的缓冲液冲洗开环质粒；然后用含1.7 M硫酸铵和0.3 M氯化钠的缓冲液将超螺旋质粒洗脱，实现开环质粒与超螺旋质粒的分离。
 

经过前两步层析，质粒的纯度和均一性（超螺旋比例）达到了新高度，最后一步层析重点是去除内毒素。来源于大肠杆菌，内毒素始终是质粒的一个重要风险杂质。市面上无内毒质粒抽提试剂盒，其内毒素能达到的标准也只有＜100 EU/mg质粒。

同裂解液的超滤浓缩一样，使用中空纤维或平板膜包，将质粒浓缩换液至制剂缓冲液中，用于转染细胞的质粒一般换液至Buffer TE中。

对该质粒三步层析中间样品进行检测，结果如下表所示。可见，经过三步层析后，超螺旋质粒纯度大于90%，内毒素和宿主DNA残留分别小于10 EU/mg和2 μg/mg。

以上为和元生物GMP平台成立以来，基于层析的某质粒纯化工艺案例分享。质粒的高质量和高纯度是确保后续裸质粒或病毒载体安全性和有效性的前提，是工业化生产步骤重要环节之一。

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