STTT（IF 52.7）|中国医学科学院肿瘤医院冉宇靓团队揭示胃癌干性“黑手”：ENO1如何让ATP与乳酸联手“喂养”肿瘤？

探讨ENO1在胃癌（GC）中的表达情况，作者使用人胃癌组织芯片进行免疫组织化学（IHC）分析。与癌旁正常组织相比，胃癌组织中ENO1的核质表达均显著升高（图1a）。此外，对特征均衡的胃癌患者进行ENO1表达分层生存分析显示，高ENO1表达患者的生存率显著低于低表达患者（图1b），且在核ENO1低表达患者中，胞质ENO1表达水平也影响生存。随后作者使用慢病毒构建PAMC82和SNU16细胞系的ENO1差异表达细胞模型，发现ENO1上调对细胞增殖无显著影响，但促进球形成（图1c）、迁移（图1d）、侵袭能力以及干性因子表达（图1e），而ENO1敲低（shENO1）胃癌细胞则呈现相反趋势。此外作者建立了小鼠模型，发现高ENO1表达显著增加肺转移并导致肺重量增加。由于转移结节过多，可能导致肺功能受损、系统性缺氧，进一步影响整体代谢和生理功能，最终导致裸鼠体重略微下降（图1f）。综上，这些结果表明高ENO1表达可能与胃癌患者不良预后及胃癌细胞干细胞样特性相关。

作者对对照组和ENO1敲低组进行了RNA-Seq分析，结果显示：敲低组细胞中共有2116个基因上调、1845个基因下调（图2a）；KEGG 和GO分析显示：差异表达基因（DEGs）主要富集于代谢通路，如糖酵解过程的正调控和AMPK/mTOR信号（图2b、c）；GSEA分析进一步显示ENO1可能介导AMPK/mTOR通路（图2d）。

为进一步探究ENO1是否在PI3K/AKT通路（糖酵解的经典调控通路）中发挥功能作用，作者进行了WB 验证后发现ENO1差异表达显著改变AKT/mTOR通路和AMPK的磷酸化状态（图2e）。接着作者使用PI3K抑制剂LY294002和激活剂740Y-P验证ENO1是否通过PI3K/AKT通路影响干性。正如预期那样，LY294002逆转了ENO1过表达诱导的PI3K/AKT通路激活（图2f），表现为AKT和mTOR磷酸化减少；相应地，ENO1过表达组在LY294002处理后球形成、迁移和侵袭能力被显著抑制（图2g；补充图2c）。同样，在shENO1胃癌细胞中加入740Y-P后观察到p-AKT和p-mTOR表达增加，提示740Y-P处理可挽救ENO1缺失引起的PI3K/AKT信号抑制；此外，740Y-P逆转了shENO1细胞中自我更新、迁移和侵袭的抑制效应。作者进一步还使用了AMPK激活剂AICAR和mTOR抑制剂雷帕霉素/激活剂MHY1485鉴定ENO1是否可失活AMPK/mTOR通路并影响干细胞样特性。结果显示：AICAR在ENO1过表达细胞中可增加磷酸化AMPK水平，表明ENO1诱导的AMPK/mTOR通路失活被逆转（图2h）；并且AICAR还削弱了ENO1过表达胃癌细胞的球体形成、迁移和侵袭能力（图2i）。此外雷帕霉素的效果与AICAR相似，能激活AMPK/mTOR通路并抑制干细胞样特性，而MHY1485则呈现相反趋势。综上，这些结果表明ENO1通过激活PI3K/AKT信号并失活AMPK/mTOR通路来增强干性。

基于上述发现，作者探讨ENO1是否通过协同介导AMPK/mTOR和PI3K/AKT通路调控干性特性，发现AICAR联合LY294002强烈抑制ENO1过表达胃癌细胞的自我更新、迁移和侵袭能力。作者进一步探究了联合信号通路抑制的潜在临床意义，结果显示使用二甲双胍（AMPK激活剂；MET）和copanlisib（PI3K抑制剂；COPAN）联合治疗结果优于单药治疗，即联合治疗显著抑制细胞活力、克隆形成、球体形成、迁移和侵袭。最后作者构建了GC小鼠异种移植模型，结果显示联合组肿瘤体积和重量低于单药组，但差异不显著。因此，旨在寻找更有效的联合治疗策略。综上，这些结果表明高ENO1水平通过协同介导PI3K/AKT激活和AMPK/mTOR失活增强干性，促进胃癌生长。

由于PI3K/AKT和AMPK/mTOR信号通路是经典的能量代谢相关通路，接下来作者分析了TCGA数据库中的肿瘤样本，发现高表达ENO1的患者呈现更高的糖酵解相关评分（补充图6a）。结合补充图6b的数据，作者对临床胃癌样本的TCGA和RNA-Seq结果分析一致显示ENO1影响两种关键糖酵解产物——ATP和乳酸的水平。

随后，作者对shcon和shENO1组细胞进行能量代谢谱分析。与shcon组相比，shENO1组有21种代谢物上调、13种代谢物下调（图3a）。KEGG富集分析显示差异代谢物主要富集于糖酵解和糖异生通路，特别是糖酵解的正调控（图3b）。糖酵解关键中间代谢物呈现显著差异，ATP和乳酸产生明显减少（图3c、d）。并且作者验证了ENO1促进乳酸和ATP水平升高（图3e）。DEGs和差异代谢物的整合通路分析显示PI3K/AKT和AMPK信号通路显著富集（图3f）。为了进一步验证ENO1诱导的干细胞样特性是否可被逆转，作者用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG）处理细胞，并检测了PI3K/AKT和AMPK/mTOR通路的调控。结果显示，2-DG降低了ATP和乳酸水平，这与shENO1组的发现一致。ENOblock和2-DG对PI3K/AKT和AMPK/mTOR通路的影响相似，表明ENO1主要通过糖酵解调控这些通路。此外，2-DG逆转了ENO1诱导的胃癌细胞自我更新、迁移和侵袭能力增加。

基于先前研究，作者推断ENO1可通过激活糖酵解并增加ATP和乳酸水平调控PI3K/AKT和AMPK/mTOR通路，从而影响干性。研究结果显示ATP产生与AMPK/mTOR通路激活呈负相关，这与Cancer Cell先前报道一致。作者随后验证了ATP和乳酸对PI3K/AKT信号通路的影响，由于ATP无法自由跨膜扩散，细胞内ATP浓度显著高于细胞外，作者通过膜通透化实验建立不同细胞内ATP浓度的细胞群，观察ATP对PI3K/AKT通路的瞬时影响（图3g），结果显示，在膜通透性增加下，ATP外流导致的ATP泄漏可通过ATP补充部分恢复，PI3K/AKT信号激活随细胞内ATP浓度变化（图3h）。此外，在膜通透化后ATP添加并恢复12 h后，结果显示肿瘤干性相关标记表达发生变化（E-cadherin下调，N-cadherin、vimentin、snail、SOX2、CD44、OCT4和Nanog上调），表明细胞内高ATP水平可通过激活PI3K/AKT信号通路促进胃癌细胞干性，并且结果还显示与迁移、侵袭和干性相关的恶性表型显著增强。

由于ENO1可调控乳酸产生，为进一步探讨乳酸的功能机制，作者发现外源乳酸补充导致细胞内乳酸水平增加，建立细胞内-外乳酸动态平衡，并促进胃癌细胞迁移、侵袭和自我更新（图4a、b）。Western blot分析提示乳酸增强干性和EMT相关分子表型，从而促进胃癌干性和EMT（图4c）。此外，通过添加不同浓度乳酸钠，胃癌细胞整体乳酰化水平逐步增加（图4e），伴随迁移能力（图4d）、球形成能力（图4d）和干性（图4e）的分子指标逐步增加。这些发现提示乳酸通过调控整体乳酰化水平促进肿瘤细胞干性。

作者进一步探讨了乳酸对PI3K/AKT通路的影响，发现乳酸促进PI3K/AKT通路激活。当乳酸与PI3K抑制剂COPAN共给药时，其相关的迁移和球形成增强（图4f）以及PI3K/AKT通路激活（图4g；补充图9c）显著减弱，表明乳酸的促肿瘤功能依赖PI3K/AKT激活。最后作者分别通过2-DG和oligoA选择性地抑制糖酵解和线粒体ATP的产生，研究结果显示，经过2-DG处理后，外源性乳酸没有增强迁移或球体形成或激活PI3K/AKT通路，而经oligoA处理后出现了相反的结果。这些发现表明乳酸的致瘤作用依赖于糖酵解而不是线粒体来源的ATP。

考虑到细胞质ATP和乳酸的协同作用，作者提出同时靶向两种代谢物的联合治疗。鉴于未来临床应用价值，作者选择两种临床相关药物：二甲双胍（MET）和昔洛舍平（SYRO）。不同浓度MET影响细胞内ATP池，检测到细胞内ATP水平下降但乳酸水平无变化。有趣的是，数据还提出了一种新机制，即MET主要通过糖酵解而不是通过线粒体氧化磷酸化来调节ATP的产生（图5a）。此外，SYRO靶向单羧酸转运体（MCTs）破坏肿瘤乳酸稳态后，细胞外乳酸减少；还观察到ATP不明原因增加，但这种增加并不影响药物对PI3K/AKT通路的抑制作用或AMPK通路的激活。

基于剂量梯度实验的代谢物浓度和对两条通路的影响结果，作者使用MET和SYRO进一步探讨对通路和干性的协同效应。MET和SYRO联合对PI3K/AKT激活和AMPK/mTOR失活的抑制效应较单药更强。体外实验中，联合用药较单药更显著地抑制细胞活力（图5d）、克隆形成（图5e）、球形成（图5f）、迁移（图5g）和侵袭能力。在皮下异种移植瘤模型中，联合组肿瘤体积和重量显著小于单药组，表明联合治疗更有效地抑制肿瘤生长。总的来说，作者得出结论：ENO1通过直接刺激糖酵解产物协同调控PI3K/AKT和AMPK/mTOR通路，并影响ATP池和乳酸稳态，最终促进胃癌的干细胞特性和肿瘤生长（图6）。

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