转录组数据数据这么多，怎么办？怎么看？和我的研究有什么关系？
如何分析？如何从大海中捞到那根针呢？
别急，小编抛砖引玉啦~
Part1 测序数据质控评估
1.1测序数据质控评估
测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样本等多个因素的共同影响。如何评估呢？可从以下几个维度进行测序数据质量评估：1）用于后续分析的测序数据量（clean bases），如果数据量>6G，那么ok，基本上满足分析要求；如果需要更多数据量进行可变剪切或融合基因分析，没问题，加测即可；2）碱基质量值（Q20/Q30）百分比，Q20/Q30>85%-90% 说明测序质量过关。如果测序数据量和碱基质量值符合质控要求，就可以放心的往下看了呢~
1.2参考基因组比对
如果物种基因组注释比较好（如人/大鼠/小鼠等），参考基因组比对率（total mapped）一般要求是>85%（如 >85%的基因组比对率表示测序到的reads 85%以上属于该物种，说明测序样本的物种信息无误）。但如果是非常规物种或基因组注释不那么完整，那么基因组比对率要求就会适当低一些呢（>60-85%，各位看官根据实际情况进行综合判断哈）。
1.3样本生物学重复评估
假如实验设计（比较组）是 Case组 vs Control 组 、敲除/过表达组 vs 对照组等，如何看2个比较组在组学（mRNA）层面上是否有组间差异呢？样本间相关性系数分析和PCA可以提供答案。
（1）相关性系数越接近1，表明样本之间表达模式的相似度越高；对于同一组的生物学重复样本来说（如A1/A2/A3/A4/A5…），相关性系数越接近说明同组内的生物学重复越好；不同组别（A组和B组）之间的相关性系数相差越大越好，说明不同组别之间的差别越大，组间的差异基因可能越多；
（2）同样，同一组的样本越接近说明组内生物学重复越好；不同组别的样本在PCA中距离越远越好，说明组间差异越大。当然除了样本间相关性系数分析和PCA分析外，还有其他分析方法，在此先不赘述了呢~
Part2筛选差异/候选基因及结果可视化
2.1筛选差异/候选基因
默认将padj小于0.05，|log2(foldchange)| 大于1作为筛选差异基因的标准（见下表），可发现哪些基因在2组中发生了显著性变化（显著上调或者显著下调表达），这些显著变化基因极有可能和处理组/疾病组等显著相关，可作为后续研究的候选基因。
如果筛选出来的差异基因可能比较多怎么办呢？通过差异倍数（FoldChange）、padj/p（越小越好）、基因在各个样本的中表达情况（FPKM）、基因功能注释等这些因素进行进一步筛选，以进一步缩小候选基因范围。如果差异基因较少，反其道行之，放宽筛选标准，使更多的基因出现。当然，实际筛选过程中，依据实际项目情况进行个性化调整~
2.2 差异/候选基因可视化展示
筛选出差异/候选基因后（建议10-100个基因内），如果对这些基因进行可视化展示呢？热图、火山图、PPI网络图来啦~
热图可以清楚地展示基因在各个分组/样本中的表达情况（颜色越红表达越高）；火山图可以特异性展示差异/候选基因的差异倍数和显著性情况；PPI网路图可以帮助展示这些基因之间的相互作用（基因A与其他基因的连线越多，说明与其互作的基因数越多，基因A调控/受调控的基因越多，基因A的作用可能越重要）。
Part3功能富集分析及结果可视化
3.1 差异基因功能富集分析
差异基因的GO/KEGG富集散点图是富集分析结果的一种可视化展示方式。默认挑选富集显著的 Top20 GO term/pathway进行展示，此图中通过Rich factor、P value 和Gene number (富集到此通路上的基因个数)来衡量其富集程度。当然，如果有特别关注/感兴趣的GO term/pathway，也可以针对目标term 进行个性化调整，以实现对特定功能类别的聚焦。
3.2 GSEA富集分析
GSEA 不关注某几个表达发生显著改变的基因，而是整个表达数据在特定功能基因集中的表达一致性，以此来解读数据中蕴含的生物学信息。因此GSEA可以避免差异表达分析中阈值筛选带来的问题。如下图，此图中主要通过NES、P/FDR (显著性，越小越显著)来衡量其富集程度。NES正值表示在左侧（A组）组别中显著性富集，说明该term 在A组中处于激活状态，反之在B组中处于抑制状态；NES负值表示在右侧（B组）组别中显著性富集，说明该term 在B组中处于激活状态。如果有特别关注/感兴趣的GO term/pathway，可以单独展示其富集情况哈~
Part4个性化分析
4.1趋势分析
趋势分析为梯度类文章的核心分析点，如实验设计（3-5组）涉及梯度处理（时间变化、药物浓度/剂量变化、疾病程度、生长周期等），利用趋势分析/时间序列分析将表达模式相似的基因进行归类，从而找到实验变化过程中最具有代表性的基因集及对应的趋势特征（如cluster），揭示在变化过程中所特有的规律。筛选到与预期表达趋势符合的cluster后，可以对特定cluster中基因进行针对性分析（如表达分析、互作分析、功能分析等）。
4.2 WGCNA分析
WGCNA（Weighted Gene Co-expression Network analysis），即加权基因共表达网络分析。WGCNA相当于对多个复杂分组进行分析，用于找寻不同分组/表型的特征基因模块，从而进行下一步分析(如可以对模块内基因进行GO/KEGG富集、PPI等等)。
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