Nat Commun | 厉害了！用T细胞杀死“T细胞”，还不会误伤友军

前言

2022年7月，上海交通大学杨选明团队在Nature Communications发表“T cell receptor β-chain-targeting chimeric antigen receptor T cells against T cell malignancies”，该研究利用T细胞恶性肿瘤中T细胞受体（T cell receptor, TCR）β链可变区的特异性，设计和构建嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR），通过一系列体外和体内实验证明这一CAR-T细胞治疗策略的安全性和有效性。

 

背景介绍

T细胞恶性肿瘤尽管在化疗下缓解率较高，但许多患者肿瘤仍然会复发，而T细胞恶性肿瘤发病机制错综复杂，小分子靶向的治疗方法难以开发，因此临床急需新的治疗策略。CAR-T细胞在B细胞来源的白血病中显示出良好的治疗效果，但用它治疗T细胞恶性肿瘤依然面临诸多困难。例如CAR-T细胞的制备过程中混有肿瘤细胞，以及CAR-T细胞自相杀伤，或杀伤正常T细胞。为避免这些问题，需要选择肿瘤细胞特异表达的抗原。

 

在T细胞发育过程中，TCR多样性来源于α链或β链可变-多样-连接区结构域（variable-diversity-joining-domain, VDJ-domain）的基因重排。TCR β链可变区的编码基因包含52个Vβ片段，1个D片段和13个J片段，同时在人体中Vβ基因片段有24个家族，每个T细胞克隆三个区各仅选择1个片段进行组合，因此，正常TCR库中单个特定TCR Vβ亚型的出现频率大约在0.58-10.84%。而发展为T细胞恶性肿瘤的T细胞克隆较为单一，通常只有1个特定的TCR Vβ及Vα亚型。作者利用这一特异性区分肿瘤细胞和正常T细胞，并应用于CAR-T细胞设计。

 

研究思路
 

01  针对特定的Vβ亚型设计CAR-T细胞，检测CAR-T细胞自身靶点表达，并通过与正常T细胞，以及Vβ8^-和Vβ8⁺配对细胞系共培养，检测Vβ8-CAR-T细胞的杀伤表型。

02  在长期持续抗原刺激下检测Vβ8-CAR-T细胞增殖、维持和杀伤能力。

03  在免疫缺陷小鼠模型中验证Vβ8-CAR-T细胞的抗肿瘤效果。

04  对靶向Vβ5的CAR-T细胞杀伤表型进行重复验证，拓宽策略适用范围。

05  检测特定亚型Vβ的T细胞缺失后对适应性免疫的影响，验证CAR-T治疗策略安全性。

研究内容
 

 首先，作者利用能够特异性识别TCR β链可变区不同V区结构域（Vβ8, Vβ5, Vβ13）的抗体，分析其氨基酸序列后提炼出相应的单链可变片段（single-chain variable fragment, scFv），并将该序列与4-1BB和CD3ζ序列整合构建CAR，用激活的原代T细胞制备靶向不同Vβ亚型的CAR-T细胞。对这些CAR-T细胞自身分别检测特定Vβ亚型阳性率，发现这些CAR-T细胞确实能特异性消除各自靶向的Vβ亚型阳性的正常T细胞，而对总Tαβ表达没有影响。将Vβ8特异的CAR-T细胞与正常T细胞共培养后，Vβ8⁺ T细胞类群比例明显下降，并且上清检测出细胞毒性相关的细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌显著增多。

 

接下来，作者利用293细胞和Jurkat细胞分别构建配对的Vβ8^-和Vβ8⁺细胞，并与对照T细胞或Vβ8-CAR-T细胞共培养，发现只有当Vβ8⁺细胞与Vβ8-CAR-T细胞共培养时，才能检测到T细胞IFN-γ、TNF-α的释放，以及granzyme B的表达，Vβ8⁺ Jurkat细胞才能被特异性杀伤，并且激活的caspase-3表达水平显著上升，表明细胞凋亡增加。

 

 

为了检测CAR-T细胞长期增殖和细胞毒性杀伤能力，作者利用辐照的Vβ8⁺ Raji细胞作为抗原持续重复刺激Vβ8-CAR-T细胞。通过检测多个不同供体来源的CAR-T细胞，作者发现这种重复的抗原刺激能够不断增加Vβ8-CAR-T细胞数目，无需为T细胞扩增做额外的基因改造，也没有出现靶向CD3或CD5的CAR-T细胞中互相杀伤的现象。而细胞毒性检测实验表明，与对照T细胞相比，不同刺激阶段的Vβ8-CAR-T细胞均能显著提升对Vβ8⁺ Jurkat细胞的杀伤。

 

 

作者进一步在体内验证Vβ8-CAR-T细胞的抗肿瘤效果，他们用免疫缺陷的NSG小鼠建立Jurkat细胞异种移植模型，静脉注射对照T细胞或者Vβ8-CAR-T细胞，结果表明经Vβ8-CAR-T细胞治疗的小鼠，流式检测其外周血、脾脏和骨髓中的肿瘤细胞数目明显降低，活体成像显示各时间点肿瘤负荷明显减少，总生存率显著提升。

 

 

利用Vβ8靶点证明靶向Vβ的策略有效后，作者并不满足于此，希望将适用范围拓展到其他T淋巴细胞肿瘤。为此，作者构建了Vβ5-CAR-T细胞，以及Vβ5阳性的肿瘤细胞CCRF-CEM和Hut-78 T细胞系。与靶向Vβ8的实验结果一致，在Vβ5-CAR-T细胞制备的过程中，自身表达Vβ5的正常T细胞被清除。体外共培养实验中，Vβ5-CAR-T细胞能够特异性杀伤Vβ5⁺的CCRF-CEM和Hut-78 T细胞，并且仅在它与Vβ5⁺细胞共培养时分泌IFNγ。同样在体内实验中，Vβ5-CAR-T细胞注射能够显著降低Vβ5⁺的CCRF-CEM异种移植肿瘤负荷，并且显著延长荷瘤小鼠生存期。

 

 

靶向Vβ的策略虽然显示较好的抗肿瘤效果，但仍存在一定风险，CAR-T细胞会攻击自身表达所靶向Vβ亚型的正常T细胞，故作者接下来对这一策略安全性进行评估。因为体内某特定Vβ亚型的T细胞仅占所有T细胞的一小部分，作者猜测相比于靶向所有T细胞（例如CD5、CD7或CD3）的CAR-T治疗策略，这一小部分T细胞的缺失不会产生严重的免疫抑制。为了验证这一猜想，作者建立了选择性去除Vβ8⁺ T细胞的小鼠模型。Vβ8特异性抗体的检测表明小鼠中Vβ8⁺ T细胞约占总正常T细胞的21.5%。作者利用相同scFv片段制备Vβ8重组抗体，模拟长期Vβ8⁺ T细胞的缺失，并用CD3ε抗体处理的小鼠作为阳性对照。

 

随后作者对该小鼠模型注射DEC-OVA疫苗，发现Vβ8抗体处理的小鼠产生DEC-OVA抗体的水平，以及OT-I特异的T细胞应答水平与野生型小鼠类似，而CD3ε抗体处理的小鼠产生的DEC-OVA抗体显著减少，OT-I特异的T细胞应答则完全被抑制。作者进一步对接种B16-OVA肿瘤细胞的小鼠进行抗肿瘤免疫检测，发现Vβ8⁺ T细胞缺失小鼠的肿瘤生长曲线与野生型小鼠基本一致，而由CD3ε抗体处理后所有T细胞缺失的小鼠肿瘤生长更加迅速。因此Vβ8⁺ T细胞缺失的小鼠细胞和体液免疫反应几乎不受影响。

 

 

 综上所述，文章利用TCR β链可变区的特定亚型作为靶点，建立特异性的CAR-T细胞治疗策略，并证明该策略能够有效杀伤特定亚型的T细胞恶性肿瘤，同时保留充分的适应性免疫功能，对临床有一定的指导意义。

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