2022年5月的春风拂面而过，不知不觉中深埋在口罩里的高材生们，就到了一年的毕业季，此时很多应届毕业的硕博都忙着写文章投文章，搞的焦头烂额，想要在毕业前的一点时间里做出属于自己的学术成果。然而也有一些人，早早就拿到了文章接收函，此时正在跟自己的红颜知己享受校园青春中最纯粹的一段快乐时光。是因为实验不努力么？是因为科研的敏感性差么？其实都不是的，在我看来，最大的原因在于不了解肿瘤方向发文章的“套路”。
为了解决这个问题，微风在这里选择2022年5月发表在《CANCER GENE THERAPY》杂志，题为“CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells”的文章[1]，与大家一起共同品味肿瘤研究中的“套路”。
01 背景介绍
肝母细胞瘤是一种具有多种分化方式的恶性胚胎性肿瘤。它是由胎儿性上皮性肝母细胞，胚胎性细胞以及分化的间叶成分组成，这种疾病多发生于小儿。对于此类肿瘤，手术切除是最为有效的治疗方法，如果肿瘤是单发的、瘤体较小、位置表浅且无肝外转移，手术切除可获治愈。但是超过半数的患者在就诊的时候就失去了手术机会。并且肝母细胞瘤对放疗和化疗均不敏感，因此找寻致病进程中的关键基因，克服现有治疗方式的瓶颈显得至关重要。
CRISPR/Cas9单克隆敲除株，是利用单链导向RNA通过碱基互补配对的原理靶向基因的结合位点，随后Cas9核酸内切酶结合到与单链导向RNA形成双链的基因区域进行切割。切割形成的双链DNA断裂在细胞内被修复，造成基因敲除的主要修复机制是非同源末端连接NHEJ，这种修复将产生短的核酸插入或者删除从而导致基因移码突变。目前构建单克隆细胞株的方式主要有电转Cas9蛋白和gRNA、瞬转Cas9-gRNA质粒、慢病毒侵染、转座子构建 4种方式，目前主流的敲除株服务公司和高校及研究所的各个课题组，主要使用的是前3种方法。
图1.CRISPR/Cas9敲除原理[2]
02 技术思路
（1）使用CRISPR/Cas9敲除技术构建HuH6细胞PIM6敲除单克隆细胞系，体外检测增殖、周期、凋亡、迁移、侵袭等常规功能学。
（2）使用传统的RNA-seq技术，确定PIM3敲除后下游信号通路的变化。
（3）使用过表达质粒，扭转PIM3敲除，进行细胞功能学检测。
（4）验证PIM3敲除后，对于HuH6细胞干性的影响。
（5）体内实验验证PIM3敲除对于HuH6细胞皮下增殖能力的影响。
03 研究内容
作者首先通过瞬转Cas9和gRNA表达载体的方式，构建了HuH6 PIM3KO单克隆细胞株。并通过Western Blot鉴定敲除细胞株的PIM3表达，选择B11、D2、E8 3个敲除单克隆进行后续功能研究。作者分别使用了CTG法检测细胞增殖、台盼蓝法检测细胞存活、transwell法检测细胞的迁移和侵袭能力、流式检测了细胞的周期变化。
图2.PIM3细胞功能检测
作者通过转录组测序的方式，发现PIM3KO后，共有746个基因发生了显著性表达改变，其中378个差异基因上调，368个差异基因下调。通过IPA分析，PIM3KO明显出现了细胞死亡和分化基因的上调。其中CCR5信号通路是下调最为明显的，而此通路已经明确证实可诱导癌细胞归巢到转移部位来促进肿瘤进展。除此之外，发现了一些细胞分化通路的激活，如FXR/RXR和LXR/RXR，这也证明了PIM3具有调节肝母细胞瘤去分化的功能。
图3.转录组测序结果
作者使用过表达载体，在PIM3KO的细胞中做了回复，发现回复PIM3基因表达后，细胞增殖速度明显增加，而迁移和侵袭能力也明显得到了回复，证明PIM3的功能是真实可信的。
图4.回复实验
由于在转录组测序的结果中发现PIM3基因与细胞去分化有关，因此作者想验证一下PIM3基因与肿瘤干性的关系，首先文章鉴定了干性最常规的指标CD133并通过成球实验证实PIM3KO后明显降低HuH6细胞干性。同时也测定了其他干性的biomarker，例如Oct4、Nanog、Sox2、Nestin，证实了PIM3确实影响肿瘤干性。
图5.PIM3基因影响肿瘤干性
至此，作者完成了所有体外实验，但是由于文章完整性的要求，又进行了体内实验的检测。首先构建了皮下移植瘤模型，测量了生长曲线和生存曲线，并用免疫组化检测了KI67的表达，确定了PIM3KO后，会影响肿瘤的在体增殖。
图6.PIM3基因功能在体验证
总结一下，通篇文章只是证明了PIM3在肝母细胞瘤中的作用和机制这件很简单的事情，就发表了影响因子在6分左右的文章。它值得学习的地方在于设计的套路，使用单克隆敲除株探索基因功能，使用测序发掘通路差异，最后再进行通路检测和回复实验，套路化明显，思路直白清晰，非常合适硕士博士们模仿，快速发表文章。
参考文献
[1]Raoud Marayati, Laura L. Stafman et al.CRISPR/Cas9-mediated knockout of PIM3 suppresses tumorigenesis and cancer cell stemness in human hepatoblastoma cells.Cancer Gene Ther. 2022 May ; 29(5): 558–572. doi:10.1038/s41417-021-00334-4.
[2]TianzuoZhan,NiklasRindtorff et al. CRISPR/Cas9 for cancer research and therapy.Seminars in Cancer Biology Volume 55, April 2019, Pages 106-119，doi：org/10.1016/j.semcancer.2018.04.001.
