滴度、空壳率、内毒素 | 您的rAAV载体能满足实验需求么？

过去几年出现的几起rAAV基因疗法致死事件，均与接受高剂量rAAV有关，因此在实际研究或临床治疗中并非rAAV的剂量越高，效果就越好。研究报道，过高剂量的rAAV，随着衣壳剂量的增加，使得对衣壳特异性T细胞活化，诱导免疫反应从而清除转导的靶细胞，导致治疗效果丧失，甚至由于严重的免疫反应导致死亡。低剂量的rAAV有可能被anti-AAV抗体，甚至低滴度的中和抗体中和，从而导致效果不明显。因此精确的rAAV滴度测定、合适的载体剂量范围区间，是保证使用最佳效果的重要前提。

图1 载体剂量与系统载体转染后效果之间的关系

（Mingozzi et al., 2013）

rAAV载体的纯度要求和杂质控制是载体制备、纯化、质控过程中的重要因素，是顺利开展临床前实验和临床研究的先决条件。在rAAV载体制备过程中，除了含有全长DNA基因组的完整rAAV载体外，有一定比例的rAAV颗粒不含任何DNA基因组，被称为空病毒颗粒。

大量空病毒颗粒的存在可能会影响rAAV载体的有效性和安全性，它们可能作为抗原的供应源，引起细胞免疫毒性；亦有可能竞争细胞表面受体结合位点，影响转录效率。因此优化生产工艺，探索控制空壳rAAV产生的办法；建立有效纯化方式，去除空壳rAAV是rAAV载体生产工艺重要任务，对于获得可靠、稳定、有效的研究数据至关重要。

图2 和元生物rAAV载体生产空壳率

电镜结果：包装DNA基因组的病毒颗粒为实心颗粒（红色箭头）；空病毒颗粒中间存在空洞（黄色箭头）

随着rAAV载体的基础研究和临床应用的不断发展，使用高质量的rAAV载体可以为实验数据的稳定性和可靠性及临床治疗的安全性和有效性提供保障。

基于12年、30000+的病毒生产经验，和元生物持续优化病毒生产全流程，选择GMP级的质粒，官方授权的293T细胞完成病毒包装。建立标准三级细胞库，每月更换细胞，保证代次；优化质粒配比、病毒收获时间，借助超离、PEG沉淀、超滤、层析等科研及工业生产中的整合纯化工艺，持续降低rAAV载体的空病毒颗粒及内毒素残留，经多次随机检测rAAV载体空壳率<2%、内毒素含量均＜2.5EU/mL，远超出行业标准。同时，对生产的每批rAAV产品在出库前均会进行物理滴度测定，通过qPCR绝对定量的方式进行基因组拷贝数测定和考马斯亮蓝染色检测病毒衣壳蛋白，以保证产品的滴度准确。