撰文|罗兆莉 审阅|李纤
先天免疫系统经过精密调节能够对外界的各种刺激快速做出反应，以维持内环境稳态1。巨噬细胞是一种先天免疫细胞，在吞噬、抗原呈递和分泌细胞因子等方面发挥着重要作用2。其中，巨噬细胞吞噬功能的失调与多种疾病的发生或加重密切相关，如慢性阻塞性肺疾病3、动脉粥样硬化4、阿尔茨海默病5和中风6等。因此，控制巨噬细胞吞噬作用对于维持健康和治疗疾病至关重要。
衣康酸（itaconate）是一种具有抑制细菌感染、细胞内病毒复制和巨噬细胞炎症的三羧酸循环代谢产物，在线粒体基质中由免疫应答基因1（immune-responsive gene 1, Irg1）编码的Irg1酶催化顺乌头酸脱羧产生7。然而，目前关于Irg1/itaconate轴是否参与调节巨噬细胞的吞噬作用及其潜在机制知之甚少。
2024年2月6日，首都医科大学基础医学院李纤、杨菲教授课题组在柳叶刀《Lancet》的子刊eBioMedicine杂志上发表了题为“Targeted macrophage phagocytosis by Irg1/itaconate axis improves the prognosis of intracerebral hemorrhagic stroke and peritonitis”的研究论文，文章阐明了Irg1/itaconate轴通过Keap1/Nrf2/CD36通路促进巨噬细胞的吞噬功能，在脑出血和腹膜炎小鼠模型中均展现出改善预后的显著作用。
作者为全面探索Irg1/itaconate轴对巨噬细胞功能的影响，首先在体外原代培养骨髓来源的巨噬细胞，并进行全转录组水平测序（RNA-seq）与分析。通过GSEA分析，4-OI（4-octyl itaconate，衣康酸的代谢衍生物，具有较高的细胞膜通透性）促进吞噬作用相关的基因发生富集。作者进一步利用慢病毒在原代巨噬细胞中过表达Irg1（pSlenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-Acod1-3×FLAG-WPRE，图1l, m）、提取Irg1-/-和同窝对照小鼠的原代巨噬细胞，并通过Time-lapse、Flow Cytometry和免疫荧光染色等方法，全面地证实Irg1/itaconate轴促进巨噬细胞吞噬功能的新作用，并揭示了Irg1/itaconate轴促进的吞噬功能几乎没有底物特异性（大肠杆菌、红细胞和死亡的肿瘤细胞）。
图1 Irg1/itaconate轴促进巨噬细胞的吞噬功能
作者为明确Irg1/itaconate轴促进巨噬细胞吞噬功能的分子机制，通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和RNA-seq比较分析发现，Irg1/itaconate轴促进Nrf2进入细胞核，并增加CD36的转录和表达，从而促进巨噬细胞的吞噬能力。衣康酸是一种α, β-不饱和二羧酸，具有轻微的亲电特性，使其可以作为迈克尔受体修饰半胱氨酸残基，称之为衣康酸化（也称为2, 3-二羧基丙烷化）8。作者进一步利用Keap1半胱氨酸位点突变的慢病毒感染巨噬细胞（pSlenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-Keap1 (C151S)/(C288S)-3×FLAG-WPRE，图2a-e），通过细胞核和细胞质蛋白分离、real-time RT-PCR和免疫荧光染色等方法证明，Irg1/itaconate轴主要通过烷基化修饰Keap1上半胱氨酸151发挥的促吞噬作用（图2k）。
图2 Irg1/itaconate轴通过调控Keap1/Nrf2/CD36信号通路促进巨噬细胞吞噬作用
脑出血（Intracerebral hemorrhagic stroke, ICH）是死亡率和致残率最高的卒中亚型9。长期以来，脑出血急性期的临床治疗侧重于降颅压和防止血肿扩张，但目前仍没有药物或手术疗法可以显著改善患者的功能预后。ICH后脑内血肿的急性占位效应引起原发性脑损伤，进而引起继发性脑损伤，导致神经功能缺损10。因此，ICH后尽早、尽快地清除血肿是减轻脑损伤的根本措施。为明确Irg1/itaconate轴是否可以促进血肿清除，作者利用巨噬细胞/小胶质细胞（microglia/macrophage, MMΦ）内条件性Irg1敲除小鼠（Irg1 cKO）及其同窝对照小鼠发现，MMΦ中Irg1的缺失减少了其对红细胞的吞噬，从而加重了小鼠的神经功能缺损和运动功能障碍（图3a-d）。侧脑室注射衣康酸钠/腹腔注射4-OI可以促进MMΦ清除血肿，改善小鼠的行为学预后（图3e-h）。为进一步明确Irg1/itaconate轴在体内是否也通过Nrf2/CD36信号通路来调节MMΦ吞噬血肿，作者分别在侧脑室内注射Nrf2 siRNA、Nrf2药理学抑制剂ML385 或 CD36 中和抗体，并在ICH后给予4-OI治疗。结果显示，沉默Nrf2（图3i, j）或抑制Nrf2/CD36信号通路（图3k, l）明显减弱4-OI促进的血肿清除作用，并加剧小鼠的神经功能缺损和运动功能障碍。这些结果证明，Irg1/itaconate轴通过调节Nrf2/CD36信号通路促进MMΦ清除血肿并改善脑出血的急性期预后。
图3 Irg1/itaconate轴增强MMF清除血肿并改善脑出血的急性期预后
巨噬细胞是机体抵御病原体入侵的第一道防线，具有溶解、吞噬和消灭病原体的作用11。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）是一种机会性病原体，是医院获得性、医疗保健相关和社区获得性感染的主要原因12。细菌性腹膜炎由宿主腹腔巨噬细胞的吞噬和杀菌能力下降而引起13，增强巨噬细胞的吞噬能力以减少细菌负荷已成为重症细菌性腹膜炎的治疗策略。为明确Irg1/itaconate轴是否可以促进巨噬细胞吞噬细菌，作者利用腹腔注射S. aureus建立急性腹膜炎模型发现，与对照小鼠相比，Irg1 cKO小鼠腹腔巨噬细胞吞噬的S. aureus更少，小鼠的运动功能更差（图4a-d）。利用喂养巨噬细胞清除饲料PLX5622、腹腔注射中性粒细胞的中和抗体，作者发现，Irg1/itaconate轴主要是通过促进巨噬细胞吞噬细菌，而不是中性粒细胞（图4e-h）。
图4 Irg1/itaconate轴增强巨噬细胞吞噬S. aureus并改善急性腹膜炎的预后
综上所述，在此研究中，作者在不同来源的巨噬细胞(小鼠骨髓来源的巨噬细胞、原代小胶质细胞和腹膜巨噬细胞)、不同的疾病模型(ICH和腹膜炎)中发现，Irg1/itaconate轴促进巨噬细胞的吞噬作用，并受共同的Keap1/Nrf2/CD36分子机制调控。这些发现填补了衣康酸在巨噬细胞吞噬作用的知识空白，也为开发基于巨噬细胞的细胞疗法或基于衣康酸疗法为治疗吞噬作用相关疾病提供了重要的研究基础。
图5 文章总结图
首都医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系的博士研究生罗兆莉为本文的第一作者，首都医科大学基础医学院李纤教授、杨菲教授为本文的通讯作者。此研究得到了首都医科大学基础医学院安静教授课题组的大力支持，并在国家自然科学基金面上项目（32070735、82371321和82271240）、北京市自然科学基金项目和北京市教委科研重点项目（KZ202010025033）和首都医科大学临床基础联合实验室的资助下完成。
李纤，首都医科大学基础医学院教授、博士生导师，现任生物化学与分子生物学系副主任。主要以出血性脑卒中为疾病模型，研究中枢神经系统疾病的神经保护和免疫调控。先后承担多项国家自然科学等省部级以上基金项目，在《Brain, Behavior, and Immunity》、《Cancer Research》、《Clinical Cancer Research》、《eBioMedicine》、《Redox Biology》等杂志上发表多篇论文。
杨菲，首都医科大学基础医学院教授、博士生导师，现任神经生物学系主任。主要研究慢性疼痛的分子机制。先后承担多项国家自然科学等省部级以上基金项目，在《Science Advances》、《Journal of Neuroinflammation》、《Pain》、《Anesthesiology》等杂志发表论文多篇。
李纤团队和杨菲团队诚邀优秀博士后加盟，欢迎联系（qianli@ccmu.edu.cn, feiyang@ccmu.edu.cn）
第一作者罗兆莉（一排右3），
通讯作者李纤（一排右6）、杨菲（二排右4）
（照片提供自李纤实验室）
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2352396424000288
和元助力
和元生物有幸为研究者提供实验中使用的如下病毒载体，以实际行动助力基础科学研究！
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病毒名称 |
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pSlenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3×FLAG-WPRE |
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pSlenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-Acod1-3×FLAG-WPRE |
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pSlenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-Keap1-3×FLAG-WPRE |
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pSlenti-EF1-EGFP-P2A-Puro-CMV-Keap1 (C151S)-3×FLAG-WPRE |
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pSlenti-EF1- EGFP-P2A-Puro-CMV-Keap1 (C288S)-3×FLAG-WPRE |
参考文献
1. Morrissey MA, Kern N, Vale RD. CD47 Ligation Repositions the Inhibitory Receptor SIRPA to Suppress Integrin Activation and Phagocytosis. Immunity 2020; 53(2): 290-302 e6.
2. Germic N, Frangez Z, Yousefi S, Simon HU. Regulation of the innate immune system by autophagy: monocytes, macrophages, dendritic cells and antigen presentation. Cell Death Differ 2019; 26(4): 715-27.
3. Hodge S, Hodge G, Scicchitano R, Reynolds PN, Holmes M. Alveolar macrophages from subjects with chronic obstructive pulmonary disease are deficient in their ability to phagocytose apoptotic airway epithelial cells. Immunol Cell Biol 2003; 81(4): 289-96.
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5. Hansen DV, Hanson JE, Sheng M. Microglia in Alzheimer's disease. J Cell Biol 2018; 217(2): 459-72.
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