慢病毒系列|让你“随心所欲”调控基因（热点研究篇）

非编码RNA与疾病研究
 

 人类基因组中研究得最多的是编码蛋白质的基因序列，仅占基因组的1.5%，如果考虑非编码区（UTR）将增加至2%。近年研究发现，基因组的非编码部分对机体的正常发育、生理和疾病至关重要，其功能与疾病发生的相关性研究早期聚焦在microRNA（miRNA）上。然而，miRNA只是冰山一角，其他非编码RNA（ncRNA），如环状RNA（circRNA）、长链非编码RNA (lncRNA)、核仁小RNA (snoRNA)等的异质性不仅与肿瘤的发生相关，还与神经、心血管、发育等多种疾病相关。 

研究最广泛的一类是miRNA，这是一种长度约为22个核苷酸（nt）的小非编码RNA，它通过控制mRNA翻译成蛋白质来介导转录后基因沉默。据估计，miRNA调控超过60%编码基因的蛋白质翻译，参与包括增殖、分化、凋亡和发育等过程。 

环状RNA（circRNA）是一类特殊的ncRNA分子，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解，也是新的研究热点。近期研究表明，circRNA富含miRNA结合位点，起到miRNA海绵（miRNA sponge）的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用。通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。 

长链非编码RNA (lncRNA)是一组长度超过200nt的非编码转录本，参与多种生物学过程，是哺乳动物非编码转录组中最多的一类。目前提出lncRNA对基因表达的转录调控机制是通过招募染色质复合物重塑到特定位点来介导DNA的表观遗传修饰。 

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lncRNA——原系统 VS Vpack系统

 

案例1——慢病毒＆microRNA（干扰）
 

M2 microglia-derived extracellular vesicles promote white matter repair and functional recovery via miR-23a-5p after cerebral ischemia in mice

作者单位：上海交通大学

IF:11.6

 

脑白质修复对缺血性卒中后的认知和神经功能恢复至关重要。M2型小胶质细胞被证实可促进髓鞘再生，其细胞外囊泡(EVs)介导脑损伤后的细胞功能修复。然而，M2型小胶质细胞来源的EVs在促进脑缺血后的脑白质修复及其潜在机制尚不清楚。本研究证明M2-EVs可缩小脑萎缩体积，促进体内功能恢复、少突胶质生成和白质修复，增加体外少突胶质祖细胞（OPC）增殖、存活和分化。miR-23a-5p在M2-EVs中富集，可以促进OPC的增殖，存活和成熟，而在M2-EVs中敲低miR-23a-5p可以逆转M2-EVs在体内外的有益作用。M2型小胶质细胞可通过M2-EVs与OPCs沟通，并通过miR-23a-5p促进白质修复，其机制可能与miR-23a-5p直接靶向Olig3有关，提示M2-EVs有望成为脑卒中和脑白质脱髓鞘修复的新治疗策略。 

图1：由M2-EV所提供的miR-23a-5p在促进少突胶质原发生中是必不可少的

Yongfang Li et al., Theranostics. 2022; 12(7): 3553-3573.

 

★细胞系：小神经胶质细胞BV2

★基因调控手段：基因干扰（LV-sh miR-23a-5p）

 

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案例2——慢病毒＆microRNA（过表达）

Exosome-Mediated miR-21 Was Involved in the Promotion of Structural and Functional Recovery Effect Produced by Electroacupuncture in Sciatic Nerve Injury.

作者单位：上海中医药大学

IF:7.31

 

本研究旨在探讨电针通过调节外泌体的释放及外泌体介导的miRNA-21 (miR-21)传递促进神经再生的机制，进一步研究施万细胞 (SC)来源的外泌体对miR-21过表达治疗外周神经损伤（PNI）的影响。研究发现电针在PNI模型大鼠的早期阶段抑制血清外泌体miR-21的释放，而在后期阶段促进其释放。电针增强miR-21在损伤神经中的聚集，有效促进PNI后神经功能的恢复。当通过miR-21-5p-sponge抑制循环外泌体的释放或下调损伤局部组织中miR-21的表达时，电针的治疗效果减弱。正常SC分泌的外泌体具有促进神经功能恢复的能力，而miR-21过表达增强了外泌体的这一作用。此外，SC分泌的外泌体miR-21可促进神经突在体外生长。外泌体介导miR-21转运揭示了电针对PNI的作用机制，为利用外泌体介导的miR-21作为治疗PNI的新策略提供了理论基础。

 

图2：外泌体miR-21调控坐骨神经远端基因表达水平

Yu-pu Liu et al., Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2022 Jan 29.

 

★细胞系：施万细胞（周围神经系统中的神经胶质细胞称施万细胞）

★基因调控手段：基因过表达（LV-miR-21-5p-OE）

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案例3——慢病毒＆circular RNA（干扰）

CircMET promotes tumor proliferation by enhancing CDKN2A mRNA decay and upregulating SMAD3

作者单位：南京大学

IF:41.444

 

circMET (hsa_circ_0082002)是一种来源于MET基因的环状RNA，其功能尚不完全清楚。本研究以circMET上调的Xp11.2易位/NONO-TFE3融合性肾细胞癌(NONO-TFE3 tRCC)为研究对象，探讨其在肿瘤进展和转录后调控中的机制。研究表明：NONO-TFE3 tRCC组织和细胞中，NONO-TFE3融合上调circMET的表达，过表达circMET显著促进NONO-TFE3 tRCC的生长。机制研究证明，circMET通过YTHDC1以N⁶ -甲基腺苷(m⁶A)依赖的方式被递送到细胞质中。circMET通过直接相互作用并募集YTHDF2来增强CDKN2A mRNA的衰减，同时circMET竞争性消除miR-1197并抑制SMAD3 mRNA的表达。综上所述，circMET促进NONO-TFE3 tRCC的发生发展并对CDKN2A和SMAD3均有调控作用。circMET有望成为NONO-TFE3 tRCC以及其他高表达circMET的肿瘤治疗的新靶点。 

图3：高表达circMET促进NONO-TFE3 tRCC的增殖

Yang et al., Molecular Cancer. 2022 Jan 18;21(1):23.

 

★细胞系：UOK109（来源于原发性乳头状细胞癌）、786-O（人肾透明细胞癌细胞）

★基因调控手段：基因干扰（LV-sh circMET）

 

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案例4——慢病毒＆circular RNA（敲低）

Down-regulating Circular RNA Prkcsh suppresses the inflammatory response after spinal cord injury

作者单位：山东大学齐鲁医院

IF:6.058

 

环状RNA (Circular RNAs, circRNAs)是一类保守的内源性非编码RNA，参与转录和转录后基因调控，在神经系统中高度富集。它们参与多种神经细胞的存活和分化，甚至可能促进卒中后神经功能的恢复。研究人员使用小鼠T9脊髓损伤模型鉴定出脊髓损伤后差异表达的circRNA和miRNA。其中，circPrkcsh的表达水平在损伤小鼠和对照小鼠之间存在显著差异。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）刺激体外培养的星形胶质细胞，用以模拟脊髓损伤后的炎症反应。结果表明，在损伤的细胞中circPrkcsh表达升高，miR-488表达降低，同时发现circPrkcsh调控炎症相关基因Ccl2的表达。此外，在TNF-α处理的星形胶质细胞中，circPrkcsh敲低通过上调miR-488的表达降低了Ccl2表达，并减少体外炎症因子的分泌。综上可知，差异表达的circRNA参与脊髓损伤后的炎症反应，并作为某些miRNA的调节者。circPrkcsh可作为miR-488海绵吸附调控Ccl2的表达，为脊髓损伤的治疗提供新的思路。

图4：circPrkcsh在体外通过海绵吸附miR-488调控Ccl2的表达。

Jia-Nan Chen et al., Neural Regen Res. 2022 Jan;17(1):144-151.

 

★细胞系：小鼠星形胶质细胞（原代细胞）

★基因调控手段：基因过表达（LV-miR-488-OE）、基因敲低（LV-miR-488-KD）

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案例5——慢病毒＆Long non-coding RNA（过表达）

Long non-coding RNA EVADR induced by Fusobacterium nucleatum infection promotes colorectal cancer metastasis

作者单位：第三军医大学（陆军军医大学）

IF:9.995

 

具核梭杆菌(F. nucleatum)和长链非编码RNA (lncRNA) EVADR均与结直肠癌(CRC)相关，但它们与CRC转移的关系以及EVADR促进CRC转移的机制尚不清楚。我们在这里报告了F. nucleatum促进结直肠癌细胞转移到肝和肺，并且在小鼠模型的CRC转移定植中可以检测到它。此外，F. nucleatum可上调EVADR的表达，从而增加CRC细胞体内外转移能力。在机制上，EVADR升高可作为Y盒结合蛋白1 (YBX1)的模块化支架，直接增强上皮-间充质转化(EMT)相关因子的翻译，如Snail, Slug和Zeb1。这些结果表明，F. nucleatum诱导的EVADR通过YBX1依赖的翻译促进CRC的转移。EVADR/YBX1轴可能有助于F. nucleatum相关CRC转移的预防和治疗。 

图5：F. nucleatum感染诱导的EVADR促进结直肠癌转移。

Xiaoxue Lu et al., Cell Reports. 2022 Jul 19;40(3):111127.

 

★细胞系：5种结直肠癌细胞（HCT116, LoVo, SW480, SW620 and HT29）、正常结肠上皮细胞系（NCM460）

★基因调控手段：基因过表达（LV-EVADR-OE）

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案例6——慢病毒＆Long non-coding RNA（过表达）

An oxygen-adaptive interaction between SNHG12 and occludin maintains blood-brain barrier integrity

作者单位：中国医科大学

IF:9.995

 

脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)的紧密连接(Tight junctions, TJs)在维持血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)完整性中起着关键作用。然而，在生理和病理刺激下，TJs稳定性的精确调控仍然是未知的。研究利用RNA免疫沉淀结合二代测序(RIP-seq)和功能鉴定，发现一个长链非编码RNA (lncRNA)—SNHG12，通过直接与TJ蛋白occludin相互作用，对维持BBB的完整性至关重要。SNHG12和occludin之间的相互作用是氧适应性的，可以阻断人BMECs中Itch (E3泛素连接酶)介导的occludin泛素化和降解。小鼠内皮细胞敲除SNHG12基因会导致occludin减少和BBB渗漏以及加重缺氧诱导BBB的破坏。脑内皮细胞过表达外源性SNHG12可减轻缺氧对BBB的损害。综上所述，研究发现了一个lncRNA对BBB完整性维持和氧适应至关重要的直接TJ调节剂——SNHG12。 

图6：SNHG12和occludin之间的氧适应性相互作用维持了血脑屏障的完整性。

Yuan Li et al., Cell Reports. 2022 Apr 12;39(2):110656.

 

★细胞系：人/小鼠脑微血管内皮细胞（HBMECs、MBMECs）

★基因调控手段：基因过表达（LV-SNHG12-OE）

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