【文库筛选】CRISPR筛选冲高分？临床转化来助力

01  前言
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2022年3月，Takashi Ishio等人在Blood发表“Genome-wide CRISPR screen identifies CDK6 as a therapeutic target in adult T-cell leukemia/lymphoma”，该研究通过全基因组CRISPR敲除筛选发现多个成人T细胞白血病淋巴瘤（Adult T-cell leukemia/lymphoma, ATLL）特异依赖的关键基因，并针对CDK6深入探究，证明TP53失活的ATLL细胞由于CDK2激活而对CDK6抑制剂更加耐受，联合mTOR抑制剂可以协同抑制不同TP53状态的ATLL细胞。该发现为临床ATLL治疗提供了新的靶点和用药策略。

02  背景介绍
 

ATLL是一类恶性的血液系统肿瘤，它与I型人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV-I）的感染有关。临床中现有的化疗效果往往不理想，长期生存率低于20%，因此急需找出调节ATLL细胞增殖生存的关键通路，以它们为靶标开发新的治疗方法。功能基因组筛选可以寻找肿瘤所依赖的关键分子，包括维持肿瘤细胞增殖和生存的关键通路。这项研究利用全基因组CRISPR-Cas9文库，对多个ATLL模型进行筛选，以期发现新的治疗策略。

03  研究思路


 

1、通过全基因组CRISPR/Cas9失活筛选寻找ATLL细胞的依赖基因，排除其他细胞普遍依赖的关键基因，确定9个ATLL细胞特异性依赖的候选关键基因。（关键基因筛选）

2、对部分候选基因逐一验证，分别对各候选基因进行敲除，检测对ATLL细胞增殖的影响，然后针对不同候选基因的功能进行相应的实验探究，证明候选基因有临床转化价值。（候选基因验证）

3、以CDK6为切入点，利用临床使用的CDK6抑制剂帕博西尼进行药物处理，证明蛋白水平抑制CDK6能够也能阻滞细胞周期、增加细胞凋亡从而抑制ATLL细胞生长。（抑制剂处理）

4、已知TP53影响CDK6抑制剂治疗效果，并且能够抑制CDK2。通过不同TP53状态的ATLL细胞系，以及构建的TP53敲除细胞系，证明TP53失活的ATLL细胞系对帕博西尼更加耐受。通过进一步敲除CDK2，证明TP53增强帕博西尼对ATLL抑制效果依赖于其对CDK2的抑制。（耐药机制探究）

5、CRISPR筛选结合通路分析发现ATLL依赖于mTORC1信号通路，经过细胞增殖以及下游分子磷酸化水平检测的验证后，分别对ATLL细胞系、患者分离的原代细胞以及小鼠异种移植模型进行CDK6和mTOR抑制剂药物处理，在体外和体内水平证明联合用药对任何TP53状态的ATLL治疗效果更加显著。（联合用药策略）
 

04  研究内容
 

作者对KK1、ST1和Su9T01这3个ATLL细胞系进行全基因组CRISPR失活筛选，在找的1278个关键基因中，排除大多数细胞都依赖的核心关键基因，以及两个套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）细胞系的关键基因，最终确定了9个ATLL细胞特异的候选关键基因。它们分别参与不同的调节通路，包括AP-1家族转录因子（BATF3和JUNB），细胞周期G1-S转换调节因子（CDK6和CCND2），JAK/STAT通路成员（STAT3和IL10RB），RNA结合蛋白（SYNCRIP和ZFP36L2），和一个异戊烯转移酶亚基（PTAR1）。
 

 

在初步验证部分候选基因后，作者以细胞周期相关候选基因为切入点深入探究。CCND1、CCND2和CCND3是G1/S期的细胞周期蛋白，它们与CDK4或CDK6相互作用形成活性激酶，通过磷酸化并抑制Rb蛋白促进G1-S期转换。免疫印迹显示ATLL细胞敲除CDK6后，Rb磷酸化水平降低。CDK6敲除特异性抑制ATLL细胞，并且可以被CDK6异位表达回补，CDK4异位表达回补效果较弱。与预期一致，CDK6敲除使得ATLL细胞发生G1期阻滞，此外也能诱导细胞凋亡。敲除CCND2与敲除CDK6产生的表型基本一致。
 

 

考虑到CDK6对ATLL的抑制作用，作者进一步挖掘CDK6作为ATLL治疗靶点的潜力。研究表明CDK4/6抑制剂帕博西尼能够抑制多种不同细胞系，并且在ATLL细胞系中使得Rb磷酸化水平降低、发生G1期阻滞以及细胞凋亡。既往研究发现在许多不同肿瘤类型中TP53突变与CDK4/6抑制剂耐受相关，将ATLL细胞系按照TP53的状态分组，发现TP53变异（突变或缺失）的ATLL细胞对帕博西尼更加耐受。APR-246是一种能够使突变的TP53恢复转录激活性质的小分子，TP53突变的ATLL细胞经APR-246处理后对帕博西尼更加敏感，但TP53缺失的细胞没有明细的影响。对ST1细胞进行TP53敲除后，在帕博西尼处理下其生长速度高于TP53野生型的ST1细胞。TP53敲除介导的帕博西尼耐受也体现在细胞增殖、周期和凋亡等表型。TP53能通过诱导p21表达阻止G1/S期转换，p21结合并抑制CDK2/Cyclin E。在ST1细胞中，CDK6的失活或抑制会增加p21和CDK2抑制因子p27的表达，但TP53基因失活的ATLL细胞系中不会出现这一情况，表明帕博西尼对ATLL细胞产生理想的抑制效果可能需要抑制CDK2。确实，对TP53突变的KK1和TP53缺失的Su9T01细胞或敲除TP53的ST1细胞在进一步敲除CDK2后，帕博西尼处理下的生长速度下降。至此，作者揭示了TP53能通过抑制CDK2增强ATLL对帕博西尼的敏感性。
 

 

通过对CRISPR筛选结果进行通路分析，发现ATLL细胞依赖mTORC1信号通路。MTOR敲除能够抑制多种ATLL细胞生长，免疫印迹显示ST1细胞中mTOR下游通路分子处于磷酸化状态。鉴于既往研究显示CDK和mTOR抑制剂联合用药对不同类型肿瘤的有益效果，作者利用mTOR抑制剂与帕博西尼处理不同ATLL细胞系，结果显示mTOR抑制剂与帕博西尼可以协同抑制不同TP53状态的ATLL细胞，两抑制剂联合作用对Rb磷酸化水平的抑制效果也高于分别单独用药。
 

 

作者进一步对ATLL患者原代细胞进行探究，与细胞系实验结果一致，帕博西尼能够浓度依赖地抑制ATLL原代细胞增殖，在联合mTOR抑制剂后抑制程度增加，而对其他正常的T细胞没有明显影响。为在体内水平探究联合用药的安全性和有效性，作者将ATLL细胞接种至小鼠体内建立异种移植模型并给药，结果显示mTOR抑制剂与帕博西尼分别单独用药时即可抑制移植瘤生长，联合用药后的抑制效果则更加显著，同时药物处理对小鼠体重没有显著影响，证明这一策略的安全性和有效性。
 

 

综上所述，这篇文章利用CRISPR/Cas9文库寻找ATLL关键基因，选择临床可靶向的激酶CDK6作为切入点，探讨治疗效果和耐药机制，并提供新的联合用药策略，研究思路值得借鉴。

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