细胞功能学实验

细胞增殖

　　细胞增殖与细胞凋亡、细胞周期等是病因研究的重要表型，是分子生物学和药理学研究解决的问题之一。通过在细胞中过表达或干扰某个基因研究基因对细胞增殖能力的影响，进一步研究基因的功能，或对细胞进行药物处理，研究药物对增殖的影响。

　　实验原理(CCK-8)

　　细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖，是生物体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖的研究方法有很多，主要包括：CCK8/ CellTiter-Glo™等方法。

　　Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。


　　CCK-8方法优势：

　　 1 操作简单，避免细胞计数过程中人为因素的影响；

　　 2 细胞用量少，检测灵敏度高，稳定；

　　 3 可反复用酶标仪读板，检测时间灵活，不影响细胞进行后续实验；

　　 4 CCK-8产生的Formazan是水溶性的，无需换液，尤其适用于悬浮细胞,与MTT法相比更方便，更安全。

　　目的：考察目的基因对细胞的增殖能力产生的影响或药物对细胞增殖能力的影响

　　材料：目的细胞、稳转株（空载、目的基因）

　　步骤：细胞收集——细胞铺板——（药物处理）——细胞培养0、6、24、48、72小时后加入CCK-8处理，酶标仪检测

　　

　　实验原理(CellTiter-Glo™)

　　ATP腺嘌呤核苷三磷酸参与生物体内多种酶促反应，是活细胞新陈代谢的一个指标，其含量直接反应了细胞的数量及细胞状态：实验过程中向细胞培养基加入等体积CellTiter-Glo™试剂，测量发光值，在光信号和体系中，发光值与ATP量成正比，而ATP又和活细胞数正相关，因此可通过检测ATP含量得细胞活力。

　　CTG方法优势：

　　1 同普通的MTT、CCK8法相比，CellTiter-Glo™发光活细胞检测系统具有最高灵敏度和较长的信号持续时间，此系统已经广泛地应用在生命科学研究领域中，如一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗病毒药物筛选、细胞毒性试验以及病因放射敏感性测定等;

　　2 CellTiter-Glo™试剂和细胞培养中的常用培养基兼容，如RPMI1640、MEM、DMEM和 Ham's F12，也不受酚红和有机溶剂的影响，误差小，准确率高。

　　目的：考察目的基因对细胞的增殖能力产生的影响或药物对细胞增殖能力的影响

　　材料：目的细胞

　　步骤：细胞收集——细胞铺板——（药物处理）——细胞培养0、24、48、72、96小时后加入CellTiter-Glo™溶液用微孔板震荡器5分钟，于室温放置10分钟-酶标仪检测荧光值



细胞凋亡

　　细胞凋亡是病因和发育研究的重点，同时也是药理学研究的热点。细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自主结束其生命的过程。它是一个主动的，高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化（Caspase）→进入连续反应过程。

　　基本原理

　　细胞凋亡检测采用Annexin V/PI双染法检测，Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）高亲和力特异性结合。在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。将Annexin V 进行荧光素（FITC或PE）或Biotin 标记，以标记了的Annexin V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

　　7-AAD类似于碘化丙啶（propidine iodide，PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中细胞和死细胞，7-AAD能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin V 与7-AAD 匹配使用，就可以将凋亡早细胞以及死细胞区分开来。

　　目的： 通过慢病毒感染获得过表达某基因的细胞株，利用Annexin-PE和7-AAD双染法对正常细胞、对照组细胞、基因过表达组细胞的凋亡情况进行检测，研究基因对细胞凋亡的影响。

　　材料：质粒与细胞株

　　步骤：细胞准备——收集细胞——Annexin-PE和 7-AAD进行双染色——流式上机检测



细胞侵袭和迁移

　　在病因发展过程中，细胞进入循环系统的能力是重要的研究对象。相关的信号通路主要可以分为控制细胞黏附和控制细胞骨架。细胞的迁移与侵袭主要与细胞骨架和黏附相关。坏细胞侵袭和迁移能力的改变通常采用Transwell进行检测。细胞划痕也是测定坏细胞运动特性的方法，由于无法区别正常增殖和迁移细胞，应用有局限性。

　　
       Transwell实验

　　Transwell小室底层的一张有通透性的膜（一般为聚碳酸酯膜），将其放置于孔板中，小室内称上室，培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

　迁移实验：研究细胞的迁移能力或特定情况下坏细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜，上室种坏细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，坏细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映坏细胞的迁移能力。

　侵袭实验：研究细胞的侵袭能力或特定情况下细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，上室种细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室，计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

　　目的： 研究目的基因过表达/干扰对细胞侵袭等能力的影响

　　材料：正常细胞、对照慢病毒、过表达基因慢病毒

　　步骤：细胞复苏——Transwell铺板——细胞培养及染色——拍照

　　

　　划痕实验原理

　　坏细胞在体外仍具有迁移的能力。细胞划痕法是测定了坏细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后比较不同实验组中坏细胞迁移的能力。

　　目的： 使用筛选的稳定株（转对照病毒、过表达基因病毒），通过对空细胞、对照稳转、目的基因稳转三组细胞进行划痕宽度进行统计学分析，研究基因对细胞迁移能力的影响。

　　材料：病毒和细胞株，目的细胞来源于客户，稳定株和元构建

　　步骤：细胞铺板——划线——细胞培养及拍照——统计分析



细胞周期检测

　　细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期反应了细胞增殖速度，单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。

　　原理：细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的 G0/G1期具有二倍体细胞的DNA 含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI 即碘化丙锭，可以与细胞内DNA 和RNA 结合，采用RNA酶将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA 结合的PI 的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

　　因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为 G0/G1期，S 期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。

　　目的： 通过慢病毒感染获得基因过表达的细胞株，利用PI染色法结合流式细胞术检测各组细胞周期的变化。从而研究目的基因对细胞周期的影响。

　　材料：目的细胞、病毒

　　步骤：细胞准备——样品收集——上机检测——数据分析



克隆形成实验

　　原理：单个细胞在体外增殖6代以上（时间约1周以上），其后代所形成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3 - 1.0mm之间。细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数， 但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖并形成克隆。只有同时具有贴壁和增殖活力的细胞才会形成克隆。克隆形成率反映细胞的独立生存能力的强弱，用于评价细胞群体依赖性和增殖能力。由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强； 二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，坏细胞强。克隆形成率与接种密度有一定关系，做克隆形成率测定时，接种细胞一定要分散成单细胞悬液，直接接种在培养皿中，持续一周以上，随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。

　　目的：通过目的基因过表达/干扰细胞组、空细胞组与阴性对照组(空病毒)克隆形成数量的统计学分析，研究基因对细胞群体依赖性和增殖能力的影响。

　　材料：病毒和细胞株

　　步骤：铺板——细胞培养——观察克隆，染色，计算克隆形成率