双萤光素酶检测实验中的双萤光素酶包含两种，一种是作为报告基因的萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase简称F-Luc），另一种是作为内参的海肾萤光素酶（Renilla luciferase简称R-Luc），两种萤光素酶的底物和辅因子不同。F-Luc需要萤光素、氧气、ATP、镁离子等，发光颜色黄绿色，波长550-570nm；R-Luc仅需要腔肠素和氧气，波长480nm。在细胞中同时表达F-Luc和R-Luc，F-Luc作为报告基因反应目的基因表达的改变，R-Luc作为内参基因，为试验提供一基准线（减少内在变化因素如培养细胞的数目，细胞转染和裂解的效率对实验准确性的影响）。所构成的报告系统广泛用于靶基因验证和启动子活性的研究。


   ●靶基因验证
   miRNA主要通过作用于靶基因的3’UTR起作用（降解或抑制翻译），将目的基因3’UTR（野生型和结合位点突变型）序列构建至载体中报告基因F-Luc的3’端，通过比较过表达miRNA后，报告基因表达的改变（萤光素酶的活性下降还是不变），来确定miRNA与靶基因3’UTR的作用位点。

●启动子活性研究
   转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。



   ●启动子活性研究
   转录因子主要通过作用于靶基因的启动子起作用，将目的基因启动子区序列替换报告基因F-Luc的启动子，通过共表达转录因子后，报告基因表达的改变，来确定转录因子与靶基因启动子结合位点及对靶基因的作用。


   根据实验目的设计实验方案—预测结合位点--构建野生/突变报告基因载体系统---共转染细胞---检测酶活
   

   ● 验证miRNA同mRNA靶向互作。将靶mRNA的3’UTR序列插入报告基因载体，再共转入该miRNA，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。 

   ● 验证miRNA同circRNA靶向互作。将circRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。 

   ● 验证miRNA同lncRNA靶向互作。将lncRNA序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，检测萤光素酶活性。

   ● 启动子活性分析。将启动子区域序列进行分段截短，再分别构建入报告基因载体，检测其启动子活性。

   ● 验证特定转录因子同启动子的作用。将启动子区域插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转该转录因子，分析转录因子过表达是否提高萤光素酶活性。 

   ● 分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原件序列构建入报告基因载体，在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响应。